音達日-4味湯提取物對小鼠鎮(zhèn)痛、解熱及抗菌作用研究

昂格力瑪，吳圓圓，紅 梅，宮菊花，王 歡

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043）

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 乙酸乙酯，富宇精細化工（天津市）有限公司；高活性干酵母，安琪股份有限公司；吐溫40，科密歐化學(xué)試劑（天津市）有限公司；MH肉湯培養(yǎng)基，信裕生物科技（上海）有限公司；二甲基亞砜，麥恪林生化科技（上海）有限公司；苯扎溴銨溶液，利爾康科技（山東）股份有限公司。音達日-4味湯由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供。

1.1.2 實驗動物 昆明種小鼠（雌雄各半），SPF級，體質(zhì)量18~22 g。小鼠購自沈陽本溪實驗動物中心，許可證號：SCXK（遼）2019-0023。

1.1.3 菌株來源 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus heamolyticus）、腸球菌（Enterococcus galinarum）、表皮葡萄球菌（Staphyloccocus epidermidis）、白色念珠菌（C.albicans）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、肺炎克雷伯菌（K.peneumoniae）、銅綠假單細胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、炭疽芽胞桿菌（Bacillus anthraci）、陰溝桿菌（Enterobacter cloacae）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）。除銅綠假單細胞菌（CV CC3359 Pa.1）、炭疽芽胞桿菌（63001-7，A16R）2種菌株為中國藥品生物制品檢定所的教學(xué)實驗菌株外，其他9種菌株從臨床標本分離和鑒定。待上述11種菌培養(yǎng)16 h后，使用MH肉湯把菌苔稀釋成1×105CFU·mL－1菌液，備用。

1.1.4 儀器設(shè)備SHIMADZU AUY 120電子天平，SHIMADZU CORPORATION JAPAN；調(diào)溫電熱套，猙城華魯（山東）電熱儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，普渡（上海）生化科技有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，鴻都（上海）電子科技有限公司；純水機，捷創(chuàng)偉業(yè)（北京）環(huán)保設(shè)備有限公司。電子體溫計，豪潤奇（鄭州）電子科技有限公司；智能熱板儀，泰盟科技（成都）有限公司。高壓滅菌器，施都凱（上海）儀器設(shè)備有限責任公司；干烤箱，精宏（上海）實驗設(shè)備有限公司；CO2培養(yǎng)箱，F(xiàn)ORMA STERI-CYCLE CO2Incubator；酶標儀，Multiscan-MK3；DONGL I ANHAER APPARATUS生物安全柜，東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司；細菌比濁儀，珠海迪爾公司；自動細菌鑒定和藥敏系統(tǒng)，亞洲珠海迪爾生物儀器有限公司。

1.2 實驗方法［7-11］

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 乙酸乙酯提取物的制備 取音達日-4味湯散500 g，用乙酸乙酯按1∶20的比例水浴加熱回流2次（300 mL×2），每次3 h，合并2次提取液，以3 000r·min－1的速率離心10 min后，上清液轉(zhuǎn)放至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對乙酸乙酯進行回收，剩余物體則為提取物，晾干備用。

1.2.1.2 干酵母混懸液的制備 稱取高活性酵母粉10 g，加入純水，配成20%濃度的干酵母混懸液。

左室心肌肥厚程度 與假手術(shù)組比較，模型組LVS-BW 比和 LVS-RV比顯著增加 （P＜0．05）。與模型組比較，Rut低、高劑量組和陽性對照組LVS-BW比和LVS-RV比均顯著降低 （P＜0．05），見表2。

1.2.2 音達日-4味湯解熱作用 昆明種健康小鼠在相對濕度60%左右，溫度為22~26℃的實驗環(huán)境下喂養(yǎng)7 d，后每間隔1 h，用電子體溫計測定所有小鼠的肛溫1次，共測量3次后計算其平均值，計算結(jié)果則作為小鼠的基礎(chǔ)體溫。同時去除體溫波動較大的小鼠，選擇體溫范圍37~38℃的小鼠32只，雌雄兼用。隨后將32只實驗小鼠隨機分為模型組（給予同等體積的吐溫40），音達日-4味湯散低（21 g·（kg·d）－1）、中（42 g·（kg·d）－1）、高（84 g·（kg·d）－1）劑量組等4組，每組8只。連續(xù)給藥7 d后4組小鼠背部皮下均注射提前配制的20%濃度的干酵母混懸液，注射量為10 mL·kg－1。待實驗小鼠發(fā)熱后，選擇2 h、4 h、6 h、8 h等時間點對其進行肛溫測量，每個時間點測一次即可。

1.2.3 音達日-4味湯鎮(zhèn)痛作用 選取體重范圍為（20±2）g的健康昆明種小鼠每間隔30 min測量其痛閾值，共測2次，其中，熱板溫度（55±0.5）℃，實驗小鼠置于熱板上到舔后足反應(yīng)發(fā)生的時間為痛反應(yīng)的潛伏期。篩選出痛反應(yīng)較穩(wěn)定、不跳躍者、且痛閾值在5~30 s的32只小鼠，雌雄各半，隨機分成模型組（給予同等容量的吐溫40）及音達日-4味湯低（21 g·（kg·d）－1）、中（42 g·（kg·d）－1）、高（84 g·（kg·d）－1）劑量組等4組，每組8只。連續(xù)給藥7 d，隨后再次測定4組實驗小鼠的疼痛反應(yīng)，對音達日-4味湯低、中、高劑量組等給藥組小鼠與模型組小鼠的痛閾值進行比較，分析數(shù)值變化，找出組間差異，并對蒙藥音達日-4味湯散的鎮(zhèn)痛作用等問題展開討論。

1.2.4 音達日-4味湯抑菌殺菌實驗

1.2.4.1 微孔板TTC法測定音達日-4味湯乙酸乙酯提取物MIC取無菌96孔細菌培養(yǎng)板，每孔加MH肉湯培養(yǎng)基100 μL，再加音達日-4味湯散乙酸乙酯提取液100 μL，倍比稀釋法加至第10孔混合后棄去100 μL混合液（藥物終濃度為2.3 mg·mL-1）。第11孔加陽性對照藥液，即苯扎溴銨（最終濃度為0.15 μg·μL-1），第12孔設(shè)定為陰性對照，不加藥液。再加用MH肉湯稀釋的1×105菌液100 μL菌液，每孔中加入0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）溶液，密封后，在潮濕環(huán)境35℃下培養(yǎng)，每小時觀察一次，至出現(xiàn)明顯的紫色為止。在450 nm波長處測定OD值。

1.2.4.2 瓊脂平板連續(xù)稀釋法測定音達日-4味湯乙酸乙酯提取物MIC取直徑為9 cm的滅菌平皿，為方便辨別，在其對應(yīng)的點種位置上做好菌名等標記后，依次加入提前配制好的不同梯度濃度的藥液1.5 mL及MH瓊脂培養(yǎng)基13.5 mL，充分混勻后，平放，待其凝固，在每個細菌點種位置上分別加入配制好的菌液2 μL（約104個細菌），35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。細菌具體點種位置如圖1所示。

圖1 細菌點種位置Fig.1 The position of bacterial dibbling

1.2.4.3 瓊脂平板轉(zhuǎn)種法測定音達日-4味湯乙酸乙酯提取物MBC制備MH平板時，以音達日-4味湯散乙酸乙酯提取物針對每種細菌所出現(xiàn)的MIC數(shù)值為依據(jù)。待“1.2.4.1”項實驗結(jié)束，即判讀完MIC數(shù)值后，從96孔微孔板中分別吸取2 μL培養(yǎng)液，點種涂布到MH平板上。放置35℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPSS18.0軟件對本文所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及分析，其中，各組之間的差異采用雙因素方差分析比較其顯著性意義，通過均數(shù)標準差（）來表示所有計量資料。采用t檢驗進行差異的顯著性檢驗，以P＜0.05定為顯著性界限。

2 結(jié)果

2.1 音達日-4味湯解熱作用實驗結(jié)果

見表1。

表1 音達日-4味湯解熱作用實驗結(jié)果Tab.1 Experimental results of antipyretic effect of Yindari-4 decoction n=8，

表1 音達日-4味湯解熱作用實驗結(jié)果Tab.1 Experimental results of antipyretic effect of Yindari-4 decoction n=8，

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別模型組低劑量組中劑量組高劑量組給藥量/(g·kg-1）—12 24 48給藥前體溫/℃37.20±0.58 37.24±0.32 37.30±0.35 37.36±0.29不同給藥時間體溫/℃2 h 37.73±0.48 37.81±0.33 37.24±0.40*37.25±0.43*4 h 37.78±0.54 38.41±0.27 37.20±0.78*37.05±0.50**6 h 37.90±0.59 38.41±0.46 37.13±0.43*37.83±0.19*8 h 38.07±0.54 37.77±0.29 37.18±0.37**36.92±0.95*

由表1得出，與模型組比較，音達日-4味湯散乙酸乙酯提取物中、高劑量組造模后2 h、4 h、6 h、8 h均能明顯降低小鼠體溫，中劑量組在造模后8 h體溫值有顯著性差異（P＜0.01），高劑量組在造模后4 h體溫值有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 音達日-4味湯鎮(zhèn)痛作用實驗結(jié)果

見表2。

表2 音達日-4味湯鎮(zhèn)痛作用實驗結(jié)果Tab.2 Experimental results of analgesic effect of Yindari-4 decoction n=8，

表2 音達日-4味湯鎮(zhèn)痛作用實驗結(jié)果Tab.2 Experimental results of analgesic effect of Yindari-4 decoction n=8，

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別模型組低劑量組中劑量組高劑量組劑量/(g·kg-1)—12 24 48痛閾值/s 13.13±6.18 19.50±10.70 25.11±12.43*28.01±12.12**

由表2得出，在小鼠給藥后測定其痛閾值，與模型組比較，音達日-4味湯乙酸乙酯提取物的中劑量組（P＜0.05）、高劑量組（P＜0.01）小鼠的痛閾值明顯升高。

2.3 微孔板TTC法測定音達日-4味湯乙酸乙酯提取物MIC實驗結(jié)果

見表3。

表3 微孔板TTC法測定音達日-4味湯乙酸乙酯提取液抑菌濃度實驗結(jié)果Tab.3 Experimental results of detection of antibacterial concentration of ethyl acetate extract of Yindari-4 decoction by microporous plate TTC method

實驗結(jié)果顯示，音達日-4味湯乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌抑制濃度最低。抑菌濃度數(shù)值最高的是表皮葡萄球菌、腸球菌及大腸埃希菌。

2.4 瓊脂平板法測定音達日-4味湯乙酸乙酯提取物MIC實驗結(jié)果

見圖2及表4。

表4 瓊脂平板法檢測音達日-4味湯乙酸乙酯提取液抑菌濃度實驗結(jié)果Tab.4 Experimental results of detection of bacteriostatic concentration of ethyl acetate extract of Yindari-4 decoction by agar plate method

圖2 瓊脂平板細菌培養(yǎng)結(jié)果Fig.2 Results of bacteria cultured on agar plates

從圖2、表4得知，音達日-4味湯乙酸乙酯提取液對金黃色葡萄球菌、腸球菌抑菌濃度最低。音達日-4味湯乙酸乙酯提取液對表皮葡萄球菌、炭疽芽胞桿菌及大腸埃希菌等3種細菌抑制濃度最高。

2.5 瓊脂平板法測定音達日-4味湯乙酸乙酯提取物MBC實驗結(jié)果

見表5。在瓊脂平板上的每種細菌的相應(yīng)點種位置上，若點種及涂布過培養(yǎng)液，但完全沒有生長出細菌則定為MBC，即最低（小）殺菌濃度。其中，在細菌的接種位置上，如果生長2個或2個以下的菌落時選擇忽略不計。

表5 瓊脂平板法測定音達日-4味湯乙酸乙酯提取液殺菌濃度實驗結(jié)果Tab.5 Experimental results of determination of bactericidal concentration of ethyl acetate extract of Yindari-4 decoction by agar plate method

從表5得出，音達日-4味湯乙酸乙酯提取液對金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌殺菌濃度最低，對鮑曼不動桿菌殺菌濃度最高。

3 討論

蒙藥傳統(tǒng)方劑音達日-4味湯散的主治病癥為腸熱痢疾、腹痛及腹瀉等，此類病癥在臨床上主要有腹痛，并伴有發(fā)熱，與西醫(yī)臨床上因病原微生物的感染而引起的臨床癥狀相似。因此，筆者進行了小鼠熱板儀疼痛實驗和酵母菌引起的解熱實驗，研究結(jié)果表明，音達日-4味湯散乙酸乙酯提取物中劑量和高劑量造模后2 h、4 h、6 h、8 h均能顯著降低體溫；實驗藥物中劑量及高劑量鎮(zhèn)痛作用較為明顯，并與音達日-4味湯散臨床應(yīng)用非常吻合；該結(jié)果進一步證明音達日-4味湯散作用有效部位為乙酸乙酯提取部位。

在體外抑菌方面，目前，金黃色葡萄球菌作為醫(yī)院感染的致病菌中主要細菌，可產(chǎn)生多種毒素和侵襲性酶，從而增加引發(fā)多種感染的可能性，例如：皮膚軟組織、呼吸道及手術(shù)部位的感染等［12］。金黃色葡萄球菌具有分布廣泛、致病性強及耐藥性高等特點［13］。由于該感染菌對環(huán)境的適應(yīng)性較強，容易在醫(yī)院內(nèi)傳播流行，已成為醫(yī)院最常見的革蘭氏陽性菌之一，甚至在一些醫(yī)院引起爆發(fā)流行［14-15］。

腸球菌為寄存于人類及動物的腸道中眾多正常細菌中的一員，以前一直被人們認為是對機體無害的細菌，然而最近研究表明，由腸球菌而引發(fā)的感染病例數(shù)量正在日益增加。目前，該病菌已經(jīng)成為引發(fā)醫(yī)院感染的病原菌中重要的一種細菌，會對人體的多個器官，例如：尿路、皮膚軟組織等產(chǎn)生嚴重的感染。此外，腸球菌還可引起心內(nèi)膜炎、腦膜炎及敗血癥等疾病，嚴重時甚至會危及患者生命［16］。近年來，在臨床治療藥物的使用問題上，隨著抗菌藥物廣泛使用現(xiàn)象的加劇，腸球菌的耐藥種類及耐藥性在不斷增長，然而目前依然缺乏其特效藥物。

根據(jù)本研究結(jié)果分析，蒙藥音達日-4味湯散的乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌和腸球菌具有明顯抑制作用，且抑制用藥濃度非常低，尤其是對腸球菌抑制效果較好，并且對由此而引起的臨床上發(fā)熱、疼痛癥狀具有較好的治療作用。因此，本次研究結(jié)果分析音達日-4味湯散乙酸乙酯提取物是該方藥在臨床上應(yīng)用清熱、止瀉等功效的作用部位。