枸杞多糖保護人臍帶間充質干細胞對抗氧化損傷研究

王程，韓發彬

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250300；2.山東省聊城市人民醫院組織工程與再生醫學實驗室，山東 聊城 252000）

近年來，干細胞治療神經系統疾病逐漸成為醫學領域的研究熱點，在神經系統的修復與再生的研究中得到廣泛的應用，隨著醫學及科學技術的不斷進步，對干細胞療法研究日益深入，關于干細胞療法的作用機制不斷被發掘，并逐步走向臨床［1?2］。人臍帶間充質干細 胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC－MSCs）取材于人的臍帶，是一種成體干細胞，與其他來源的干細胞相比，具有免疫原性低、非侵入性收獲、易于體外擴增、采集過程方便和自我更新速度快等優點［3］，且不存在倫理問題，是組織修復的重要來源。因此，HUC－MSCs 是一種非常有前途的治療候選細胞，在神經系統損傷修復研究中具有廣闊的應用前景［4］。研究表明，神經組織中含有大量易被氧化的不飽和脂肪酸以及低水平的抗氧化物質，使HUC－MSCs易受到活性氧的損傷，導致HUC－MSCs 移植后出現HUC－MSCs 凋亡，存活率降低，限制了HUC－MSCs 移植的治療潛能［5］。因此，如何提高HUC－MSCs 存活率，降低凋亡的發生是HUC－MSCs移植療法亟待解決的關鍵問題之一。

枸杞多糖（LBP）是枸杞子中主要活性成分之一，具有抗氧化［6］和神經保護［7］等多種生物活性。LBP 可以通過增加巨噬細胞的NO 和酸性磷酸酶產生，增強巨噬細胞吞噬能力，并在體外產生明顯的抗氧化活性；LBP 還能有效降低CoCl2誘導的低氧RGCs 細胞模型發生，且能減少RGCs 細胞的凋亡，抑制氧化應激反應和減少線粒體膜的電位差，從而對細胞產生抗氧化保護作用［8］。但LBP 能否提高HUC－MSCs 抵抗氧化損傷的能力仍需進一步驗證。因此，本實驗通過過氧化氫（H2O2）誘導 HUC－MSCs 凋亡，探討LBP 對HUCMSCs氧化應激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物與試劑

人臍帶間充質干細胞（HUC－MSCs）由聊城市人民醫院干細胞再生實驗室提供（已鑒定并發表）。枸杞多糖（LBP）（UV ≥ 90%，北京索萊寶生物技術有限公司，批號：615C021）；DMEM/F12 培養基（美國 Thermo Fisher 公司，批號：8121468）；胎牛血清（FBS，美國 Thermo Fisher 公司，批號：2233788CP）；胰蛋白酶溶液（美國 Thermo Fisher 公司，批號：2276862）；CCK－8 試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：073120201102）；雙抗（美國 Thermo Fisher 公司，批號：1881451）；H2O2（Sigma－aldrich，批號：MKCL7140）；RNAiso Plus 試劑［寶生物工程（大連）有限公司，批號：AL31609A］；SYBP Green PCR Master Mix（美國 Thermo Fisher 公司，批號：2106532）；反轉錄試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司，批號：AL50948A］；活性氧檢測試劑盒（含DCFH－DA 探針，碧云天生物技術有限公司，批號：101221220429）。

1.2 實驗儀器

二氧化碳細胞培養箱（美國 Thermo Fisher 公司）；倒置顯微鏡（日本 Olympus 公司）；酶標儀（美國 Bio－Rad 公司）；熒光定量基因擴增儀（新加坡ABI 公司）；低溫高速離心機（德國艾本德股份公司）；渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；水浴鍋（上海龍躍儀器設備有限公司）。

1.3 細胞培養及處理

將HUC－MSCs 細胞復蘇后接種于含87% DMEM/F12 培養基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液+1%谷氨酸+1%非必需氨基酸培養基中，置于37 ℃、5% CO2環境中培養。待細胞基本長滿培養瓶底時，用胰蛋白酶消化細胞使其脫壁離散，制成細胞懸液后進行傳代培養，用于后續實驗。

1.4 細胞分組及藥物溶液配制

將體外培養的 HUC－MSCs 隨機分為正常對照組（Normal Control group，NC）、H2O2處理的模型組（Model group，M）、VC 處理的陽性藥對照組（Positive control group，PC）、枸杞多糖低劑量組（Lycium barbarum polysaccharide low－dose group，LBP－L）、枸杞多糖中劑量組（Lycium barbarum polysaccharide medium－dose group，LBP－M）和枸杞多糖高劑量組（Lycium barbarum polysaccharide high－dose group，LBP－H）。其中M 組采用200 μmol/L H2O2孵育 6 h；PC 組在M 組基礎上加100 mg/L VC；LBP 各組在M 組基礎上，加入200、400、800 mg/L枸杞多糖溶液。

1.5 檢測指標

1.5.1 細胞活力的檢測

鏡下觀察細胞生長狀態，選取對數生長期的細胞，待細胞基本長滿后，去除舊培養液，加入 PBS 緩沖液洗滌1～2 次，加入胰酶消化，常規1 000 r/min 離心5 min。去除上清液，加入完全培養基混勻，細胞計數將HUC－MSCs 細胞密度調整到5 × 103/mL，接種在 96 孔培養板中，每孔添加100 μL 細胞懸液。置于 5% CO2的培養箱中培養24 h，按實驗分組加入藥物，每孔加入10 μL CCK－8 工作液，繼續孵育2 h，在酶標儀中，450 nm 波長下檢測各孔吸光度（OD）。

細胞存活率（%）=OD 值處理組/OD 值對照組 × 100%

1.5.2 活性氧（ROS）水平的檢測

①收集細胞后裝載探針：按照1∶1 000用無血清培養基稀釋DCFH－DA，使終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH－DA 中，細胞濃度為1.0 × 107個/mL，37 ℃、5% CO2細胞培養箱內孵育20 min。每隔3～5 min 顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH－DA。直接用H2O2刺激細胞，通常H2O2在刺激細胞20～30 min 后可以顯著提高活性氧水平。

②熒光分光光度計檢測：參數設置使用488 nm 激發波長，525 nm發射波長，檢測刺激后熒光的強弱。

1.5.3 凋亡相關基因的檢測

取對數期生長的HUC－MSCs 細胞，匯合度達到90%，消化，計數，按1.0 × 105個/孔鋪6 孔板。Trizol 法提取總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，按照試劑盒說明進行操作分析。

實驗結果計算：根據所測得的CT 值，目的基因的CT 值減去GAPDH 的CT 值，計算出?CT 值，再使用實驗組的?CT 值減對照組的?CT 值，計算出??CT 值，最后，2－??CT值即為所檢測目的基因的相對含量?；蛞镉缮虾Ｉど锟萍加邢薰驹O計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.6 統計學分析

所有實驗數據采用Graphpad Prism 8進行統計分析。實驗數據采用均數 ± 標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞培養狀態

復蘇后的HUC－MSCs 鏡下觀察可見細胞呈圓形或橢圓形，懸浮于完全培養基中，透亮度高。過夜培養后可見細胞完全貼壁，2 d后可見細胞呈放射狀集落改變，多數細胞成梭樣改變；4 d左右細胞呈集落生長，排列緊湊，融合面積達 90%，細胞呈平行或螺旋狀排列，表明細胞狀態良好，可用于后續實驗。結果見圖1。

圖1 HUC－MSCs的形態觀察（× 4）

2.2 各組HUC－MSCs細胞增殖及細胞活力的比較

CCK－8 結果表明，與M 組相比，LBP 能顯著提高HUC－MSCs 細胞的生長和增殖能力（P＜ 0.05），并且呈濃度與時間依賴效應。結果見圖2和表2。

圖2 各組HUC－MSCs細胞及形態觀察（× 4）

表2 各組細胞存活率的比較（±s）

表2 各組細胞存活率的比較（±s）

注：與NC組比較，△△P ＜ 0.01；與M組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

2.3 各組HUC－MSCs細胞ROS水平的比較

200 μmol/L H2O2處理6 h 后，與NC 組比較，M 組ROS 水平明顯上升（P＜ 0.01）。與M 組比較，LBP－M組和LBP－H 組ROS 水平均明顯降低（P＜ 0.01），LBP－L 組有效果但無統計學意義。以上結果表明，LBP 能顯著抑制由 H2O2誘導的ROS 的生成，降低細胞內ROS水平。結果見圖3和表3。

表3 各組細胞ROS水平的比較（±s）

表3 各組細胞ROS水平的比較（±s）

注：與NC組比較，△△P ＜ 0.01；與M組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

圖3 各組細胞熒光強度比較

2.4 LBP對氧化損傷HUC－MSCs內凋亡相關基因的影響

與M 組比較，LBP－L、LBP－M、LBP－H 組Bax、Caspase－9 和Caspase－3 mRNA 的表達均顯著下降（P＜ 0.05）。結果見表4。

表4 各組細胞Caspase－3、Caspase－9、Bax mRNA相對表達量比較（±s）

表4 各組細胞Caspase－3、Caspase－9、Bax mRNA相對表達量比較（±s）

注：與NC組比較，△△P ＜ 0.01；與M組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

3 討論

研究表明，神經退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等發病率逐年升高，嚴重影響人類健康和生活質量。這些疾病的主要特征是大腦特定疾病區域的病理變化和不同神經元的退化。人臍帶間充質干細胞治療神經退行性疾病在近年的研究中取得突破進展，如JIA 等［9］采 用AD 的衰老加速小鼠模探索臨床級HUC－MSCs對認知能力恢復的影響，發現HUC－MSCs分泌的核心功能因子HGF能通過下調過度磷酸化Tau、改善NFT、逆轉脊柱損傷和促進突觸可塑性，其機制可能與HGF 激活 cMet/Akt/GSK3β 信號通路有關，表明HUC－MSCs療法是一種有效的神經保護候選策略，可預防 AD 和其他進行性與年齡相關的神經退行性疾病。另有研究發現，甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（MPTP）誘導的PD 小鼠模型中，HUC－MSCs 的鼻內給藥明顯減輕了運動障礙并拯救了多巴胺能神經元。此外，HUC－MSC能改變腸道微生物群的組成，并調節紋狀體中的神經遞質多巴胺和結腸中的5－羥色胺水平。結果說明，HUC?MSCs 能通過改善MPTP 誘導的PD 小鼠大腦和腸道之間的聯系發揮神經保護作用［10］。但由于氧化應激可使HUC－MSCs 在神經組織中存活率較低，導致HUC－MSCs移植治療效率仍不理想。

枸杞子作為一種藥食同源的中藥，所含成分復雜，其中多糖類是重要的活性成分?，F代藥理學研究證明，枸杞多糖可以清除體內氧自由基，保護細胞免受自由基產生的過度氧化作用的影響［11?12］，具有顯著的抗氧化、抗衰老的作用。由此，筆者推測枸杞多糖（LBP）可保護HUC－MSCs對抗氧化損傷，并通過實驗探討LBP保護HUC－MSCs對抗其氧化損傷的具體機制。

本研究發現，LBP 能夠促進氧化應激狀態下HUC－MSCs 的存活能力，并探討了不同濃度LBP 對HUC－MSCs 細胞活力的保護作用，LBP 濃度越高，細胞存活率越高，并能降低細胞內ROS 生成水平，降低了凋亡相關基因的表達。

綜上所述，LBP 能夠改善氧化損傷狀態下HUCMSCs 的生存能力，提高HUC－MSCs 存活率。本實驗的結果初步表明 LBP 可保護 HUC－MSCs對抗氧化損傷，其具體作用機制有待進一步研究。