γ-聚谷氨酸—殼聚糖復合材料的制備及其止血和促創面愈合性能研究

王利振，盛文龍，李 寧，王榮春，劉可春

(齊魯工業大學(山東省科學院)生物研究所，濟南 250103)

0 引言

日常生活中經常會發生各種各樣的意外，導致皮膚組織損傷、血管破裂、血液流出。這種情況下，需要及時對傷口進行止血，以保障受損的皮膚能夠快速進行自我修復，否則極易引發傷口感染，誘發過度的炎癥反應，嚴重者可導致截肢。因此，人們迫切需要開發高效、無毒的止血材料，能夠快速封鎖傷口并止血，同時有效防止細菌感染，促進傷口愈合。

殼聚糖(CS)是自然界中唯一一種正電性多糖，具有良好的止血效果。在血液中，CS結構中的—NH2可以通過靜電作用與血小板結合，促進血小板粘附，加快血紅細胞凝結，促進血凝塊的形成[1-3]，而且，殼聚糖中正電性的—NH2可以與細胞表面負電性的生物大分子作用，堆積于細胞表面，從而改變細胞膜的通透性，影響細胞代謝，進一步起到抑制細菌增值的作用[4-6]。因此，殼聚糖被廣泛應用于制備各種止血和創面修復材料中。目前，已經上市的CS類止血或創面修復材料有TraumaStat，Celox和HemCon，其中Celox的止血產品應用最廣[7]。單一的CS成分應用于止血或創面修復材料中存在一定的局限性，例如，CS為線型大分子結構，普遍存在水溶性差的缺點[8]，此外，CS還存在吸水效率差、止血性能不佳、抗菌性能一般等缺點，極大地限制了其應用[9]。為了改善殼聚糖的止血及創面修復性能，提高其應用性，人們采取各種策略對殼聚糖的結構進行了改造。例如，通過取代反應在殼聚糖結構中引入季銨鹽結構，以達到增加正電性官能團的數量、提高抗菌性能、改善水溶性的目的[10-11]。在殼聚糖結構中引入巰基，所得的巰基殼聚糖與血紅細胞具有較好的反應性，能夠有效促進血凝塊的形成[12]。在殼聚糖結構中引入疏水性的烷基和多酚類化合物也可以提高殼聚糖的性能，疏水烷基可以使殼聚糖具有更好的細胞膜嵌入性，有利于血紅細胞的凝結和抗菌性能的提高[13-14]。多酚類化合物可以增強殼聚糖與潮濕組織的粘附性，從而起到封閉傷口的效果，促進血紅細胞凝結，加快止血速度[15-17]。結構改造的方法雖然可以提高殼聚糖的性能，但是卻極易引入毒性小分子化合物，且改造后的殼聚糖降解速率下降，存在潛在的生物安全性。

通過物理共混的方式，添加其他具有止血、抗菌、促創面修復性能的高分子材料，可以實現多種材料優異性能的高度整合，獲得結構層次豐富、性能優異的復合型材料[18]。而且物理共混不會改變材料的結構，不引入毒性小分子化合物，生物安全性高，有利于實際應用。γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過酰胺鍵連接而成的高分子聚合物，能溶于水，可降解為無毒的短肽和氨基酸[19]。γ-聚谷氨酸具有很好的粘附性、保濕性和成膜性，其結構中的羧基可以與血液中的Fe3+結合，激活凝血因子，具有一定的止血功能[20-22]。通過γ-聚谷氨酸與Ga2+進行交聯反應，制備聚谷氨酸鈣(PGAG)，再與CS混合凝膠化制備復合型聚谷氨酸鈣—殼聚糖止血材料(PGAG-CS)，一方面可以實現兩種材料不同止血機制的協同作用，提高止血性能；另一方面還可以改善單一CS水溶性差、吸水效率差的缺點，促進創面修復。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

真空冷凍干燥機(FD18S，山東博科)，場發射掃描電子顯微鏡(S-4800，日本日立)，傅里葉紅外光譜儀(Bruker AV-400)，電子天平(JA2003A，上海精天電子儀器北京有限公司)，紫外可見分光光度計(UV-2600i，日本島津)，全波長酶標儀(SPA-0093，Dynex公司)，生化培養箱(Thermo Scientific Series 8000 WJ)，臺式離心機(KL04A，湖南凱達科學儀器有限公司)。

1.2 實驗材料

殼聚糖(脫乙酰度95%，粘度100～200 mpa·s)，γ-聚谷氨酸(分子量70萬)，氯化鈣，乙酸，氯化鈉，Celox止血粉，兔抗凝全血，DMEM培養基，青霉素—鏈霉素(雙抗)，胎牛血清，二乙基二硫代氨基甲酸鋅，高密度聚乙烯，噻唑藍(MTT)，麻醉劑戊巴比妥鈉。

1.3 實驗動物

SD大鼠，平均體重300 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(魯)20190003，山東省科學院生物研究所使用許可證編號：SYXK(魯)20200015。

2 實驗方法

2.1 樣品的制備

取γ-聚谷氨酸10 g和無水氯化鈣8.4 g，加入到200 mL蒸餾水中，混合液升溫至40 ℃，攪拌過夜，反應液降至室溫，倒入1 000 mL無水乙醇中，析出大量白色固體，過濾，濾餅用無水乙醇洗滌，真空干燥，得PGAG。

取CS固體10 g，緩慢加入到500 mL質量分數為0.5%的乙酸水溶液中，得粘稠狀凝膠溶液，加入不同質量的PGAG，繼續攪拌2 h，冷凍干燥，得PGAG-CS復合材料。

2.2 紅外光譜和掃描電鏡分析

樣品的紅外光譜譜圖測試采用溴化鉀壓片法，在JEOL型掃描電子顯微鏡上進行微觀結構測試。

2.3 吸水率測試

精確稱量樣品0.2 g，用100 mL生理鹽水浸泡15 min，取出后瀝去多余水分，精確稱量其質量，計算樣品的吸水率，每個樣品平行測定3次，取平均值。

2.4 凝血指數測試

將凍干的樣品材料切成0.5×0.5×0.5 cm3的正方體小塊，放入培養皿中，37 ℃恒溫孵育5 min。吸取100 μL含有枸櫞酸鈉抗凝劑的兔抗凝全血滴加到樣品中，再向樣品中快速滴加0.02 mL濃度為0.2 mol/L的氯化鈣溶液，靜置5 min，加入25 mL去離子水，置于恒溫培養振蕩器上，在37 ℃、50 r/min的條件下，搖勻5 min；離心，取上清液，在紫外可見分光光度計上，于545 nm處測定上清液的光密度(OD)值。空白對照組操作如下：取100 μL的兔抗凝全血，加入到25 mL去離子水中，搖勻后在545 nm波長下測定OD值。每個樣品平行測定3次，取平均值。凝血指數(BCI)的計算公式如下[23]：

2.5 溶血率測試

紅細胞懸浮液的制備：取含有枸櫞酸鈉抗凝劑的兔抗凝全血1 mL，加入到10 mL生理鹽水中，搖勻，2 000 r/min離心5 min，吸出上清液，取沉淀的紅細胞，重復上述步驟2次后將所得紅細胞(記為質量分數100%)加入到24倍體積的生理鹽水中，得質量分數為4%的紅細胞懸浮液。

實驗組將PGAG-CS用生理鹽水配制成不同質量分數的懸浮液(2、4、6、8和10 mg/mL)。取每個質量分數的樣品500 μL，加入到離心管中，加入質量分數為4%的紅細胞懸浮液500 μL，37 ℃恒溫孵育3 h，2 000 r/min離心15 min，取上清液100 μL加入到96孔板中，在545 nm處，使用全波長酶標儀測定OD值。同時設置陽性對照組和陰性對照組，測定其OD值。陽性對照組是將10 mL質量分數為0.1% 的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonX-100)溶液，與200 μL質量分數為100%的紅細胞懸浮液混合均勻；陰性對照組是將500 μL的生理鹽水與500 μL質量分數為4%的紅細胞懸浮液混合均勻。每個樣品平行測定3次，取平均值。溶血率的計算公式如下[24]：

2.6 細胞毒性測試

選取CS與PGAG質量比為10∶1的樣品，測試其細胞毒性。

實驗組：無菌條件下，將0.5 g樣品加入到15 mL的DMEM培養基中(含1%的雙抗和10%的血清)混勻，37 ℃孵育24 h，5000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，濾液作為質量分數為100%的浸提液。取上述浸提液，加入到不同質量分數的DMEM培養基中，配制成質量分數為75%、50%、25%的浸提液，4 ℃冰箱保存備用。

陽性對照組：取二乙基二硫代氨基甲酸鋅0.5 g，按照上述步驟制備質量分數為100%的浸提液，4 ℃冰箱保存備用；陰性對照組：取高密度聚乙烯0.5 g，按照上述步驟制備質量分數為100%的浸提液，4 ℃冰箱保存備用[25]。

L-929細胞在DMEM培養基中培養，培養溫度為37 ℃，含5%的CO2。將對數生長期的細胞接種至96孔板中，每孔加入培養基100 μL，細胞密度約為105個細胞/孔，細胞培養24 h后，吸出原培養基，分別加入100 μL實驗組所得的浸提液(質量分數100%、75%、50%、25%)、陽性對照組浸提液和陰性對照組浸提液。空白對照組中加入100 μL新鮮DMEM培養基(每個樣品濃度設置6個平行復孔)，培養24 h后，每孔加入10 μL質量濃度為5 mg/mL的MTT(噻唑藍)溶液，繼續培養4 h，吸出原培養基，加入100 μL二甲基亞砜，避光振蕩15 min，置于酶標儀上，于570 nm處測定每孔的OD值，計算細胞存活率。

2.7 大鼠股動脈止血實驗

將禁食12 h的SD大鼠用0.5 mL麻醉劑(戊巴比妥鈉)麻醉，固定在手術臺上，用剪刀剪去大腿根部的絨毛，在腹股溝處找到股動脈，用手術刀切斷后，迅速敷上PGAG-CS材料，按壓30～60 s后松開，觀察股動脈切口的出血狀況。

2.8 促創面愈合實驗

將禁食12 h的SD大鼠用0.5 mL麻醉劑麻醉，剪去大鼠背部的絨毛，左右兩側同處開一個圓形切口，直徑1 cm。左側為空白組，右側使用PGAG-CS材料，用藥后正常飼養，中途不消毒、不換藥，觀察第3、7、14 d傷口的愈合情況。

3 結果與討論

3.1 PGAG-CS材料的結構分析

PGAG-CS、PGAG和CS的紅外光譜(FTIR)圖如圖1所示。在CS的紅外光譜圖中，1 650 cm-1處是C=O的伸縮振動峰，1 598 cm-1處是N—H的彎曲振動峰，1 087 cm-1處是C—O的伸縮振動峰，895 cm-1處是CS特有的糖環特征吸收峰。在PGAG的紅外光譜圖中，1 635 cm-1處是C=O的伸縮振動峰，1 586 cm-1處是N—H的彎曲振動峰，1 418 cm-1處是COO的對稱伸縮振動峰。在PGAG-CS復合材料的紅外光譜譜圖中，1 601 cm-1處是C=O的伸縮振動峰，1 535 cm-1處為N—H的彎曲振動峰，與CS和PGAG相比，這兩處峰的位置發生了明顯偏移，這可能是PGAG中的羧基與CS中的氨基發生靜電作用的結果。另外，在PGAG-CS復合材料的紅外光譜譜圖中，我們還可以看到COO—的對稱伸縮振動峰(1 403 cm-1)、C—O的伸縮振動峰(1 064 cm-1)和CS特有的糖環特征吸收峰(897 cm-1)。

圖1 PGAG-CS、PGAG和CS的紅外光譜譜圖Fig.1 FTIR Spectra of PGAG-CS、PGAG and CS

圖2為不同質量比的PGAG-CS復合材料(CS:PGAG=8∶1；10∶1；12∶1；14∶1；16∶1)的掃描電鏡圖(SEM)，由圖2可知，復合材料均為層狀堆積結構，具有較多的孔隙和較大的比表面積，水分子可以大量進入到孔隙中。因此，理論上材料可以快速吸收血液中的水分，使傷口處血液中的血小板和凝血因子在材料表面快速集結，濃度瞬間提高，從而加快凝血速度。當CS和PGAG的質量比為10∶1時，層狀結構最為明顯，孔隙率最高。降低CS的含量(CS:PGAG=8∶1)，層狀結構堆積效果變差，孔隙率明顯降低，這可能是由于PGAG分子的粘附性導致的。提高CS的含量(CS:PGAG=12∶1；14∶1；16∶1)，層狀堆積效果也會變差，這可能是由于PGAG含量降低后，與CS分子的相互作用程度降低導致的。

圖2 PGAG-CS復合材料的掃描電鏡圖Fig.2 SEM Pictures of PGAG-CS Composite Materials

3.2 吸水率測試

測試不同質量比例的PGAG-CS復合材料的吸水率，結果如圖3所示。隨著材料中PGAG含量的逐漸降低，材料的吸水率逐漸升高，這是因為CS凝膠化后吸水效率變高，隨著材料中CS含量的升高，吸水率相應變高。與市售的止血粉Celox相比(以殼聚糖為原料制備)，PGAG-CS復合材料具有更高的吸水效率，理論上具有更好的止血效果。

圖3 PGAG-CS復合材料的吸水率測試結果Fig.3 Water Absorption Ratio of PGAG-CS Composite Materials

3.3 凝血指數測試

凝血指數(BCI)代表材料的體外凝血性能，BCI值越低，凝血效果越好，反之則凝血效果越差。我們測試了PGAG-CS復合材料在體外的BCI值，結果如圖4所示。當材料中的CS與PGAG的質量比為10∶1時，BCI值最低(18.97%)，遠低于市售的Celox止血粉產品(34.74%)。當升高或降低CS的含量時，BCI值均升高，說明材料的凝血效果變差，這可能與材料的層狀堆積結構逐漸變差有關，比表面積的降低和孔隙的減少降低了血紅細胞在材料表面的凝結效率。

圖4 PGAG-CS復合材料的凝血指數測試結果Fig.4 Blood Clotting Index of PGAG-CS Composite Materials

3.4 溶血率測試

圖5表示不同濃度的PGAG-CS復合材料引起血紅細胞的溶血情況，很明顯，隨著材料質量濃度的逐漸升高(2 mg/mL→10 mg/mL)，材料的溶血率逐漸升高，但是只有當CS和PGAG的質量比為16∶1時，樣品的溶血率超過5%(6.01%，質量濃度10 mg/mL)，其他樣品在高質量濃度時的溶血率均低于5%。與對照品Celox相比(溶血率4.35%，質量濃度10 mg/mL)，PGAG-CS復合材料的溶血率略高(質量濃度10 mg/mL，當CS:PGAG為8∶1、10∶1、12∶1、14∶1時，溶血率分別為4.92%、4.63%、4.23%和4.66%)。圖6為各個樣品與血紅細胞結合后的溶血情況照片，每張照片從左到右依次為：陽性對照、陰性對照，樣品質量濃度為2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL。陽性對照組(tritonX-100)可以導致完全溶血，溶液為紅色，陰性對照組(生理鹽水)為澄清透明，無溶血現象發生，PGAG-CS材料與對照品Celox的溶液都接近澄清透明，幾乎無溶血現象。

圖5 PGAG-CS復合材料的溶血率測試結果Fig.5 The Hemolysis Ratio of PGAG-CS Composite Materials

圖6 PGAG-CS復合材料的溶血率測試照片Fig.6 Photos of the Hemolysis Ratio of PGAG-CS Composite Materials

3.5 細胞毒性測試

綜合分析，當CS與PGAG的質量比為10∶1時，材料具有最低的凝血指數、高的吸水效率和低的溶血率，因此我們選擇質量比為10∶1的樣品進行后續的細胞毒性測試。我們將CS與PGAG質量比為10∶1的材料溶解在DMEM培養基中制作浸提液，計為質量分數100%，并依次用DMEM培養基稀釋得到質量分數為75%、50%和25%的浸提液，并以此浸提液作為培養基培養L929細胞，采用MTT法測定細胞的存活情況，同時以二乙基二硫代氨基甲酸鋅(ZDEC)作為陽性對照組，高密度聚乙烯(PE)作為陰性對照組，結果如圖7所示。當浸提液的質量分數為100%時，細胞的存活率為87.15%，隨著浸提液質量分數的降低，細胞的存活率逐漸升高；當浸提液的質量分數降低至25%時，細胞存活率為108.61%。陽性對照組ZDEC作用下的細胞存活率為8.90%，陰性對照組PE作用下的細胞存活率為107.15%。當市售Celox止血粉浸提液質量分數為100%時，L929細胞的存活率為79.01%，低于PGAG-CS復合材料。

圖7 PGAG-CS復合材料的細胞毒性實驗結果Fig.7 Cytotoxicity of the PGAG-CS Composite Materials on L929 Cells

3.6 大鼠股動脈止血實驗

如圖8所示，以PGAG-CS復合材料按壓大鼠股動脈30 s后，材料粘附在傷口處，可達到快速止血的效果，等待3 min以上，無二次出血狀況發生。在同一只大鼠身上，切斷右側腹股溝處的股動脈，迅速敷上市售的Celox止血粉，按壓30 s后，有少量血液滲出，繼續按壓30 s后，血液滲出量變大，3 min后，出血量明顯增多。上述實驗結果表明，PGAG-CS的止血效果明顯優于市售的Celox止血粉。

圖8 PGAG-CS復合材料的大鼠股動脈止血實驗Fig.8 Hemostatic Investigation of PGAG-CS on the Femoral Arterial Hemorrhage of Rats

3.7 促創面愈合實驗

如圖9所示，PGAG-CS材料與創面接觸后具有一定的粘附性，第3 d時，創面處有少量PGAG-CS材料殘余；第7 d時，使用PGAG-CS材料的傷口直徑明顯小于左側空白；第14 d時，使用PGAG-CS材料的傷口接近愈合，而左側空白仍然有較大面積的傷口。以上結果表明，PGAG-CS材料除具有不錯的止血性能外，還對創面愈合具有一定的促進效果。

圖9 PGAG-CS對大鼠創面愈合過程的影響Fig.9 Wound-Healing Investigation of PGAG-CS on Rats

4 結論

以CS和PGAG為原料制備新型的復合止血材料，材料呈層狀堆積結構，具有較多的孔隙和較大的比表面積，有利于血小板和凝血因子在材料表面集結。材料的吸水率均在800%以上，BCI值低于市售止血粉Celox，說明其吸水迅速，與血紅細胞的結合能力較好，可有效促進血紅細胞凝結。另外，PGAG-CS復合材料具有較低的溶血率(<5%)，不會使血液中的血紅細胞破裂，引起溶血現象。當材料中CS與PGAG的質量比為10∶1時，材料的體外綜合性能最好，細胞毒性實驗結果表明材料的細胞毒性低于市售產品Celox。大鼠股動脈止血實驗表明：止血材料可以在30 s內止血，且無二次出血現象，對創面愈合也有一定的促進作用。