基于分子模擬優化篩選甲磺隆特異性多肽

尚華，趙雷興，秦月，劉冰

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

甲磺隆是一種磺酰脲類除草劑[1-2]，由于生物活性極高，甲磺隆在土壤中微量的殘留就會對后茬敏感作物造成嚴重影響[3-4]。因此深入研究其環境行為、毒性作用、污染機制及生態效應，從而有效控制它對農業生態系統和農業生產造成的危害和損失，是十分緊迫的重要課題。甲磺隆殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[5]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[6]、酶聯免疫測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[7]等傳統方法。液相色譜等大型儀器方法需要專業的儀器和技術人員，免疫方法獲得抗體周期長、不確定性高，考慮到甲磺隆的應用場景，開發能夠特異性識別甲磺隆的識別元件以及方便快捷靈敏的現場檢測方法非常必要。

分子模擬技術現已成為各應用領域科研拓展的熱點方向，希望能克服由實際試驗中試驗周期較長、類型眾多以及復雜性大等實際問題所造成的局限性[8]。Ao等[9]應用分子模擬開發出一種使用分子印跡聚合物的高選擇性樣品凈化方法。通過分子對接[10-11]，可以找到受配體結合的最有利位置、方向和構象，其對接算法和評分函數能夠生成受體-配體復合物的結構、評估結合能或親和性。Davella等[12]借助AUTODOCK對接程序分析胡椒中的某些植物化學物質對COVID-19的主要蛋白酶的敏感度。目前，較為普遍使用的分子對接程序有 DOCK、LIBDOCK、AUTODOCK、CDOCKER等。分子對接通常包括3類，剛性對接、半柔性對接、柔性對接。本文中應用的CDOCKER程序[13]屬于半柔性對接工具，應用CHARMm立場。

分子對接中的多肽片段對接也一直是對接領域的熱門話題[14]。多肽是指將3個或3個以上的氨基酸分子以肽鍵方式連結到一起的肽。Kumar等[15]通過篩選一個針對牛胰蛋白酶的500條多肽片段Maybridge庫，參與基于SAMPL3片段的虛擬篩選挑戰并評估虛擬片段篩選方法。由于多肽具有免疫原性低、生物降解性好、穿透性高、合成和修飾容易以及高親和力等優點，可作為特異性識別元件建立快捷靈敏的快速檢測方法[16-18]。

基于此，本文創新性地應用分子模擬技術設計篩選特異性識別甲磺隆目標物的多肽，探索多肽作為識別元件在檢測領域的應用。應用CDOCKER程序運行受配體對接，依據對接后蛋白空腔結構和關鍵作用氨基酸位置進行肽鏈的設計，并且應用虛擬氨基酸突變對所設計的多肽進行優化，依據分子對接結果對多肽初步篩選。應用量子點熒光淬滅免疫層析試紙條進一步驗證模擬結果并考察試驗結果和模擬結果的一致性。分子模擬技術優化篩選多肽具有省時、易制備儲存、成功率高等多種優勢，為快速獲得特異性多肽作為識別元件建立快捷靈敏的快速檢測方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲磺隆的多肽序列P14：IAVGARFDDRVWGNISKWRQGMVTQWQS；P31：AILPVRDAYHNSDKFWFWLPKHEQGRGHWAEGYARASGKPGVV；P40：VTPMADAFADGIPMVVFTGQVPTSAIGTDAFQEADVVGISRSCTKWN（純度98%，pH7.4磷酸鹽緩沖液解）：蘇州金唯智生物科技有限公司合成；甲磺隆：國藥集團化學試劑有限公司；羧基水溶性量子點：武漢珈源量子點公司；N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）、鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、二環己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide，EDC]：美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Precision T7810系列工作站：美國Dell公司；渦旋混合器（HQ-60）：北方同正生物技術發展有限公司；單道微量可調移液器、八道微量可調移液器、臺式冷凍離心機（5810R）：德國 Eppendorf公司；加熱磁力攪拌器（RH-KT）：美國 IKA 公司；分析天平（BL610）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；吸水墊、樣品墊、結合墊：上海金標有限公司；超純水系統（Milli-Q Integral）、酸纖維素膜：美國Millipore公司；紫外分析儀（ZF1-II）：上海嘉鵬科技有限公司；真空干燥箱（ZK-40RS）：天津三水科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基于分子對接設計多肽

通過查閱文獻得到甲磺隆作用于乙酰乳酸合成酶，因此在蛋白質數據庫（http：//www.rcsb.org/）中搜索乙酰乳酸合成酶，得到帶有甲磺隆配體分子的乙酰乳酸合成酶的晶體結構（PDB ID：1T9A、1T9D）。將得到的蛋白質導入到DS程序，去除結構中多余亞基、水分子和配體，加氫，大分子模塊下對蛋白質進行清理，之后設置參數準備蛋白質。在工具瀏覽器中選擇模擬，對蛋白質施加CHARMm力場。之后選擇“受體-配體相互作用”，在系統視圖中選中整個蛋白質分子，定義該蛋白質為受體，并添加活性球。甲磺隆配體分子SDF文件（Conformer 3D_CID_52999）從網站（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載并導入DS程序，在小分子模塊下將該配體進行準備及能量最小化等操作，之后在模擬板塊下對該配體添加CHARMm力場。

在工具瀏覽器中的受體-配體相互作用一欄選擇CDOCKER對接，在受體一欄選擇已經定義好的受體蛋白（蛋白ID prep：蛋白ID），在配體一欄選擇處理好的配體小分子，設置構象集群半徑為0.5，其余參數默認，點擊運行進行分子對接。對接完成后對蛋白質分子添加表面處理，觀察對甲磺隆有活性的空腔結構，結合空腔的空間結構和影響受配體相互作用的關鍵氨基酸設計新的多肽。設計原則：保留關鍵作用位點的氨基酸、盡可能保留活性空腔的空間結構。將關鍵作位點截取后進行排列組合，得到新設計的多肽。

1.3.2 虛擬氨基酸突變優化多肽

為增強多肽的穩定性和親和力，通過虛擬氨基酸突變來進一步優化多肽，將設計得到的每一條多肽均進行虛擬氨基酸突變。

將所選擇的蛋白-配體復合物導入DS窗口，在系統視圖中將配體重命名為Ligand。在工具瀏覽器中對該蛋白結構進行預處理并且添加CHARMm力場，并且以線性方式顯示每一個原子，選擇3?范圍內的氨基酸進行丙氨酸掃描，突變為丙氨酸后親和力降低的氨基酸為關鍵氨基酸。將這些氨基酸繼續進行飽和突變確定關鍵氨基酸最佳突變類型。突變后結合能沒有明顯變化或者降低則保持原有結構，突變后結合能明顯提高的結構保留突變后的結構。

1.3.3 量子點熒光猝滅免疫層析試紙條驗證

1.3.3.1 半抗原和包被原的制備

半抗原是指與目標分析物的結構相似，并具有反應活性基團的低分子質量的有機物[19]。在免疫試驗中，半抗原的分子設計與合成是建立小分子免疫化學分析方法的關鍵步驟[20]。甲磺隆結構是由苯磺酰胺和三嗪環兩部分組成，本文根據苯磺酰胺部分的結構進行甲磺隆半抗原的設計與合成[21]。

稱取5.25 mg甲磺隆半抗原、4.12 mg DCC和2.3 mg NHS置于小棕瓶中，加入200 μL N，N-二甲基甲酰胺將其攪拌溶解，磁力攪拌常溫（20℃～25℃）過夜（約12 h），即得A液；將20 mg KLH置于25 mL圓底燒瓶中，溶解于4 mL、0.13 mol/L NaHCO3緩沖溶液中，即得B液；將A液緩慢滴加到反應液B中，邊滴加邊攪拌，室溫（20℃～25℃）下反應3 h。反應后將上清液置于透析袋中，在4℃下用磷酸鹽緩沖液透析3 d，每8 h換一次透析液。透析后，得到包被原[7]。

1.3.3.2 膠體金及金標多肽探針的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[22]后，取膠體金溶液1mL置于1.5 mL進口安道管中，加入20 μL K2CO3（0.2 mol/L）和10μL多肽（1 mg/mL），混合均勻后，避光靜置于4℃冰箱1 h；加入20%BSA溶液和10%PEG 20000溶液來封閉膠體金及穩定金標多肽，靜置30 min；之后在4℃、2 000 r/min條件下離心15 min，以除去未能與多肽連接的膠體金，取上清液，在4℃、8 000 r/min條件下離心30 min，得到沉淀（金標多肽），pH7.4 PBS復溶后，4℃冰箱避光保存。

1.3.3.3 量子點-BSA的制備

采用活化酯法偶聯羧基化水溶性量子點與BSA[23]。取25 μL量子點溶液于1.5 mL的安道管中，加入硼酸鹽緩沖液（pH7.4）配制成的 2 mg/mL EDC 溶液 6 μL，攪拌均勻；加入 30 μL、10 mg/mLBSA 溶液，用硼酸鹽緩沖液（pH7.4）將混合溶液的總體積補至 200 μL，將安道管置于搖床上反應3 h；應用超濾離心管在4℃、8 000 r/min的條件下濃縮3次，每次離心15 min，得到的濃縮物用硼酸鹽緩沖液（pH7.4）復溶后置于4℃冰箱避光保存。

1.3.3.4 量子點熒光淬滅免疫層析試紙條組裝及檢測

量子點熒光淬滅免疫層析試紙條[24]組裝示意圖見圖1。

圖1 量子點熒光淬滅免疫層析試紙條組裝示意圖Fig.1 The assembly diagram of QDs fluorescence quenching immunochromatographic strip

如圖1所示，硝酸纖維素膜、吸水墊、結合墊和樣品墊依次粘貼在PVC背板上。將量子點-BSA、量子點-BSA與包被原混合物分別在硝酸纖維素膜上劃線，作為試紙條的C線（質控線）和T線（檢測線）。T線上包被原稀釋倍數為2倍；T線和C線上量子點-BSA為稀釋2倍。在對照組（不添加目標物）和試驗組（添加1 mg/L甲磺隆溶液100 μL）中，分別添加等量的金標多肽探針，混合均勻后滴加到試紙條的樣品墊處，10 min后，在紫外燈下觀察C、T線的熒光強度（每組試驗做3組平行，重復3次）。

C線作為質控線來判斷試紙條的有效性而一直有熒光，而對照組中的T線由于未添加目標物，其熒光強度應明顯低于試驗組。這是因為在對照組中，不添加目標物，緩沖液與探針由毛細管作用力向上層析到達T線，從而使T線上的量子點與膠體金發生熒光共振能量轉移[25]，熒光強度減弱或熒光淬滅；在試驗組中加入目標物，探針會先與目標物作用，使層析到T線的探針減少，從而熒光強度相比于對照組要更強。

2 結果與討論

2.1 基于分子模擬設計多肽

應用分子模擬技術將下載的蛋白分別與甲磺隆小分子進行對接，根據蛋白與配體對接的空腔結構和關鍵相互作用氨基酸進行多肽的截取及結構的設計。圖2為蛋白1T9A和蛋白1T9D分別與甲磺隆的分子對接結果。

如圖2所示，在蛋白1T9A中，依據蛋白與配體對接結果設計P1～P4四條多肽；在蛋白1T9D中，依據蛋白與配體對接結果設計出P5～P30共26條多肽。肽鏈初篩序列及其分子對接能量打分值結果見表1。

圖2 蛋白1T9A和蛋白1T9D與甲磺隆對接的晶體結構及其相互作用示意圖Fig.2 Crystal structure and interaction diagram of protein 1T9A and 1T9D docking with metsulfuron-methyl

表1 肽鏈初篩序列及其分子對接能量打分值結果Table 1 Preliminary screening sequence of peptide chain and results of molecular docking energy score

由表1可知，30條多肽與甲磺隆配體運行CDOCKER，對接結果皆良好。

2.2 運行虛擬氨基酸突變并構建多肽庫

為獲得親和力和穩定性更加優異的多肽，運行虛擬氨基酸突變對多肽進一步優化。在表1中選擇結合能較好的P1～P4以及P16、P17這6條多肽鏈進行突變。其中P3、P4、P16三條鏈突變之后結合能不變，因此保留原有結構。對P1進行多點飽和突變，當L3突變為 W3、N12 突變為 R12、Q16 突變為 W16、A26 突變為 W26，即 DMWGMHGCATARLAVWNADLIIAVGWPFDDR時，結合能為 -44.883 6 kCal/mol；對 P2進行多點飽和突變，當I4突變為Y4、T16突變為W16、E21突變為W21、E22突變為 R22，即 ADLYIAVGARFDDRVWGNISWRQGMVTQWQS時，結合能為-54.568 2 kCal/mol；對P17進行多點飽和突變，當Y10突變為 R10、I13突變為 Y13、N20突變為 W20、V22突變為W22、A30突變為R30，即YPGGAILPVRDAYHNSDKFWFWLPKHEGRGHWAEGYARASGKPGVV時，結合能-53.457 6 kCal/mol。

比較突變前的6條多肽和突變后的3條多肽的結合能，P3＞P17＞P1＞突變后的 P1＞P4＞P2＞P16＞突變后的P17＞突變后的P2，根據能量越低，多肽越穩定的原則，依次選出突變后的P2、突變后的P17和P16分別命名為S1、S2和S3，結果如表2所示，應用量子點熒光淬滅免疫層析試紙條方法進行實際驗證。

表2 肽鏈初篩序列及其分子對接能量打分值結果Table 2 Preliminary screening sequence of peptide chain and results of molecular docking energy score

2.3 量子點熒光淬滅免疫層析試紙條驗證模擬結果

基于膠體金對于量子點的熒光淬滅作用及目標物和包被原之間的競爭關系，建立基于熒光共振能量轉移的量子點熒光淬滅免疫層析試紙條，利用紫外燈照射下的對照組和試驗組之間的熒光強度差異來進一步驗證多肽在實際應用中的可行性。

在其他條件相同的情況下，將3條多肽與膠體金進行偶聯，合成3種熒光探針。應用同一批提前制備好的試紙條同時進行試驗，進一步驗證試驗結果與分子模擬結果的一致性，結果如圖3所示。

圖3 量子點熒光淬滅免疫層析法驗證多肽的有效性Fig.3 Verification of the effectiveness of polypeptides by QDs fluorescence quenching immunochromatography

如圖3所示，相對于原始組，3條多肽在T線上的熒光強度均有所下降；而相比較對照組，3條多肽在T線上的熒光強度均增強，此結果表明3條多肽均能成功識別目標物，使能夠層析到T線的探針減少，使與T線上包被原結合的探針減少，不能夠大量猝滅T線上的量子點，導致T線的熒光強度高于對照組。多肽S1制備出的熒光探針T線的熒光強度更亮，說明在其他條件相同的情況下，相比于其他兩條鏈，S1和目標物的識別能力更加優異，使得更多的探針與目標物結合，更少的探針得以進一步層析到T線淬滅量子點。在分子模擬的結果中，S1與目標物的對接結果也更加優異，結合能更低，肽鏈更加穩定，這表明模擬結果與實際驗證結果具有良好的一致性，可以得出分子模擬優化篩選得到的多肽可以作為識別元件應用到實際的檢測當中。

3 結論

應用分子模擬技術依據受配體相互作用的空腔結構及關鍵相互作用氨基酸，創新性的對多肽進行設計，運行虛擬氨基酸突變對設計得到的多肽進行突變，得到對接結果更加優異的30條多肽并且自建多肽庫（P1～P30）。依據最終的對接自由能從中初步篩選出S1、S2、S3三條結合能更小、肽鏈更穩定的多肽，應用量子點熒光淬滅免疫層析試紙條方法進一步驗證3條多肽作為識別元件的可應用性以及實際驗證結果與分子模擬結果的一致性。驗證結果表明分子模擬技術設計出的多肽能夠成功識別目標物，并且實際驗證結果和模擬結果具有良好的一致性，均是S1的表現更加優異。本試驗方法成功優化篩選出可識別甲磺隆目標物的多肽，為今后其他目標物的多肽篩選工作提供參考。