不同糖源發(fā)酵藍莓酒的品質(zhì)

唐梅霖，張愛華，曾令文*

（1.常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.常州大學(xué)城鄉(xiāng)礦山研究院，江蘇 常州 213164）

蜂蜜含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其糖類成分含量高，以葡萄糖、蔗糖和果糖為主，是天然的糖源，還含有各種酶類、蛋白質(zhì)和維生素等活性成分，具有殺菌、促進傷口愈合、促進腸胃消化的作用[1]。目前蜂蜜產(chǎn)業(yè)趨勢供大于求，一部分蜂蜜被釀造成蜂蜜酒，飲用蜂蜜酒能起到健脾通腸、養(yǎng)顏美容等保健功效，但是蜂蜜酒口味單一，不符合年輕人的市場需求，因而蜂蜜在創(chuàng)新性開發(fā)方面有待深入研究[2]。藍莓果實富含花青素、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等活性成分，具有延緩衰老和保護視力的功效，得到消費者青睞[3]。由于藍莓上市時間比較集中，保鮮儲存的成本較高，將其釀造成果酒可以極大改善浪費現(xiàn)象，并且藍莓酒富含的多酚類、黃酮類物質(zhì)能夠清除人體自由基，達到抗氧化的效果[4]。

目前人們研究藍莓酒的熱潮持續(xù)高漲，張楊等[5]的試驗表明藍莓酒經(jīng)過發(fā)酵之后仍存在許多花色苷物質(zhì)；趙慧芳等[6]將黑莓和藍莓進行復(fù)合發(fā)酵，提高花色苷的穩(wěn)定性，改善褐變現(xiàn)象，有利于多酚物質(zhì)的浸出；屈嬡等[7]通過響應(yīng)面試驗得到高酒精度藍莓酒的最佳發(fā)酵工藝條件，延長了藍莓酒的貯藏期。然而，尚未見有關(guān)不同糖源發(fā)酵藍莓酒的相關(guān)報道。

本文制備3種不同糖源（蜂蜜、黃冰糖、不添加糖源）的發(fā)酵藍莓酒，發(fā)酵過程中檢測可溶性固形物、pH值、酒精度、總酸4個理化指標的變化趨勢，通過測定抗氧化物質(zhì)（總酚、總黃酮、花青素）含量比較不同藍莓酒的抗氧化性能，將發(fā)酵果酒所測指標進行相關(guān)性分析和主成分分析，綜合評價出最佳發(fā)酵工藝，為蜂蜜和藍莓的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜、新鮮藍莓、黃冰糖：市售；釀酒酵母RB2、焦亞硫酸鉀（potassium metabisulfite，PMS）、果膠酶（3 280 U/g，以半乳糖醛酸計）、碳酸氫鉀、酵母營養(yǎng)助劑（均為食品級）：法國Laffort公司；沒食子酸標準品、蘆丁標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）標準品、三吡啶基三嗪[1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine，TPTZ]標準品：上海晶純生化科技股份有限公司；福林酚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、醋酸、醋酸鈉、濃鹽酸、三氯化鋁、無水乙醇、甲醇、氯化鐵、硫酸亞鐵、乙酸鈉、無水碳酸鈉、酚酞指示劑（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

801B型破碎機：中天炊事機械廠；HV-02型壓榨機：川泰機械廠；PAL-1手持糖度計：日本ATAGO公司；DMATM 35便攜式密度濃度計：奧地利安帕公司；雷磁PHS-3E型pH計、ZDJ-4B自動電位滴定儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀：美國安捷倫公司；UV-2600紫外可見分光光度計：日本島津儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓酒發(fā)酵工藝流程

圖1為藍莓酒發(fā)酵工藝流程。

圖1 藍莓酒發(fā)酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of blueberry wine

具體流程：用稀釋的100 mg/L PMS溶液清洗藍莓果實，挑除有瑕疵的爛果，用破碎機將果實切片，放入充有二氧化碳的發(fā)酵桶，果膠酶按照0.03 g/L的用量、PMS按照100mg/L的用量添加，攪拌均勻后放入14℃～16℃環(huán)境下靜置12 h，釀酒酵母RB2按照3 g/L的用量添加，加入2 mL藍莓果汁進行水浴加熱（30℃）活化30 min之后再接入發(fā)酵桶中，酵母營養(yǎng)助劑按照3 g/L的用量同時添加，之后在14℃～16℃環(huán)境下進行發(fā)酵。定期測定可溶性固形物、pH值、酒精度、總酸等變化直至主發(fā)酵結(jié)束，當殘?zhí)呛亢途凭茸兓骄彆r表明主發(fā)酵結(jié)束。主發(fā)酵結(jié)束后，將不同的發(fā)酵藍莓酒經(jīng)壓榨機和濾網(wǎng)過濾澄清，裝入新的發(fā)酵罐中4℃低溫陳釀1個月，陳釀結(jié)束后于60℃條件下巴氏殺菌30 min裝瓶儲存。

1.3.2 藍莓酒理化指標的測定

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[8]中的方法測定樣品可溶性固形物、pH值、總酸、揮發(fā)酸、SO2含量并進行感官評分；參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中的方法測定酒精度[9]；參照GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》中的方法測定甲醇[10]。

1.3.3 藍莓酒花青素含量的測定

采用pH示差法[11]測定波長519 nm和700 nm處吸光度。含量以矢車菊色素-3-葡萄糖苷計，花青素含量計算公式如下。

花青素含量/（mg/L）=（A×449.2×n）×1 000/26 900

式中：A為不同pH值下吸光度差值，A=[（A519-A700）pH1.0-（A519-A700）pH4.5]；n 為稀釋倍數(shù)；449.2 為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，g/mol；26 900為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，mol/cm。

1.3.4 藍莓酒總多酚含量的測定

采用福林酚法測定樣品中總多酚含量[12]，將沒食子酸標準品配制成不同濃度（0.017、0.034、0.068、0.012、0.136、0.170 mg/mL），以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。每個樣品需要平行測定3次，標準曲線方程為y=5.201 1x-0.015 7，R2=0.999 3。

1.3.5 藍莓酒總黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，測定樣品中總黃酮含量[13]，將蘆丁標準品配制成不同濃度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。每個樣品需要平行測定3次，標準曲線方程為y=7.928 5x+0.026 2，R2=0.999 1。

1.3.6 藍莓酒DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定根據(jù)Carmona-Jiménez等[14]和王純等[15]的方法測定。采用分光光度計測定波長517 nm處吸光度Ai，對照組以甲醇溶液代替樣品，測其吸光度A0。DPPH自由基清除率計算公式如下。

DPPH自由基清除率/%=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100

式中：A0為DPPH溶液與甲醇混合的吸光度；Ai為DPPH溶液與樣品溶液混合的吸光度；Aj為樣品溶液與甲醇混合的本底吸光度。

1.3.7 藍莓酒鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測定

鐵離子還原能力的測定參照文獻[16]的方法，以硫酸亞鐵溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。每個樣品需要平行測定3次，標準曲線方程為y=0.664 5x-0.037 5，R2=0.999 6。樣品最終的總抗氧化能力以硫酸亞鐵當量濃度（mmol/L）表示。

1.3.8 藍莓酒色度的測定

以樣品在波長420、520、620 nm處的吸光度之和[17]表示色度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Origin 2018作圖，SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用平均值±標準差表示。應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）、鄧肯氏新復(fù)極差法和皮爾遜相關(guān)性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中可溶性固形物、酒精度、pH值和總酸的變化

圖2為發(fā)酵過程中可溶性固形物、酒精度、pH值和總酸的變化曲線。

圖2 不同發(fā)酵體系中可溶性固形物、酒精度、pH值、總酸的變化Fig.2 Changes of soluble solids，alcohol，pH，total acid in different fermentation systems

由圖2A可知，不同糖源發(fā)酵藍莓酒中可溶性固形物含量隨著發(fā)酵時間的延長均逐漸降低，其中，添加蜂蜜和黃冰糖藍莓酒的可溶性固形物含量在發(fā)酵前10 d有著明顯的下降趨勢，之后逐漸趨于平穩(wěn)，而未添加糖的藍莓酒在發(fā)酵5 d后無明顯變化。在發(fā)酵初期，蜂蜜藍莓酒可溶性固形物含量較黃冰糖藍莓酒下降明顯，這是由于蜂蜜中所含的糖類為葡萄糖和果糖等單糖，能夠直接被酵母利用轉(zhuǎn)換成酒精[18]，而黃冰糖需要經(jīng)過酵母中的轉(zhuǎn)換酶將其分解為葡萄糖和果糖后，再繼續(xù)轉(zhuǎn)換為酒精，其發(fā)酵速度沒有蜂蜜體系快。對比發(fā)酵后期的可溶性固形物含量，蜂蜜藍莓酒高于黃冰糖藍莓酒，其原因是蜂蜜除含有糖類這些主要物質(zhì)外，還含有其他非糖類的可溶性成分，也使得酒體更加醇厚[19]。

酒精是酵母利用糖分轉(zhuǎn)換而得，由圖2B可知，不同藍莓酒的酒精度隨著發(fā)酵時間延長逐漸升高，酒精度的變化總體呈現(xiàn)上升的趨勢且前期酒精度上升速度比后期快，這與圖2A中可溶性固形物的含量變化一致，說明前期的酵母菌活力與后期相比發(fā)生了改變，前期酵母菌的活力高、代謝旺盛，而后期酵母菌的活力降低、代謝能力減弱[20]。隨后，由于酸度的增加，發(fā)酵的環(huán)境變差，酵母發(fā)酵受到影響，導(dǎo)致發(fā)酵速度降低，酒精含量的增加幅度變得緩慢。在發(fā)酵前5 d，蜂蜜體系的酒精度明顯高于黃冰糖體系，這是由于蜂蜜中的單糖直接被酵母利用，而黃冰糖中的單糖需要時間轉(zhuǎn)換。在發(fā)酵5 d～10 d時，2個體系的酒精度趨于一致，這可能是由于黃冰糖中的單糖被酵母轉(zhuǎn)換成酒精，蜂蜜體系中單糖的利用接近尾聲。發(fā)酵后期，蜂蜜體系的酒精度依然高于黃冰糖體系，是因為酵母對蜂蜜中碳水化合物的利用率高于黃冰糖，最終得到的酒精度較高。不添加糖的藍莓酒由于沒有足夠糖分，酵母所轉(zhuǎn)換的酒精度只能維持在4%vol以內(nèi)。

合適的pH值有利于酵母菌的生存[21]，因此在對比蜂蜜和黃冰糖體系的發(fā)酵性能時，均將其調(diào)整為3.4，由圖2C可知，3個體系的pH值在發(fā)酵初期均呈現(xiàn)下降趨勢，蜂蜜體系在第4天出現(xiàn)上升，而其他2個在第5天發(fā)生變化，這是因為發(fā)酵前期糖分可以為酵母提供生長繁殖的能源，發(fā)酵體系內(nèi)部的微生物能夠促進有機酸的生成，有機酸的含量逐漸變多，因此前期的pH值呈現(xiàn)出下降的趨勢。發(fā)酵5 d后，pH值開始逐漸上升，這是因為前期生成的酒精和有機酸在發(fā)酵體系內(nèi)部發(fā)生了酯化反應(yīng)，生成了新的酯類物質(zhì)，給藍莓酒增添風(fēng)味。在發(fā)酵后期pH值略有波動，這可能與發(fā)酵體系內(nèi)部微生物的作用相關(guān)。在第15天蜂蜜藍莓酒的pH值處于最低水平，這是因為有機酸含量高于其他2個體系。

由圖2D可知，總酸在發(fā)酵過程中對酵母的生長和酒體的風(fēng)味起著重要作用[22]，在發(fā)酵初期會產(chǎn)生乙酸、琥珀酸、蘋果酸和丙酮酸等，導(dǎo)致藍莓酒總酸升高。到發(fā)酵后期，部分乙酸被酵母還原成乙醇，蘋果酸也可能在適溫條件下被酵母降解，其中一部分酸進行乳酸發(fā)酵，多元酸轉(zhuǎn)變成一元酸；同時部分酸與醇形成酯類物質(zhì)，使得到的總酸含量降低[23]。3種藍莓酒的產(chǎn)酸趨勢相似，蜂蜜藍莓酒總酸含量在第4天開始有下降的趨勢，而黃冰糖藍莓酒和不加糖藍莓酒在第5天開始有下降的趨勢，這與pH值的變化規(guī)律一致。發(fā)酵期間總酸含量有波動，這可能是因為發(fā)生蘋果酸-乳酸反應(yīng)。在第15天蜂蜜藍莓酒的總酸含量處于最高水平，這與pH值結(jié)果相一致。

2.2 藍莓酒考察指標測定結(jié)果

對3種發(fā)酵藍莓酒第15天的各項參數(shù)進行整合，結(jié)果見表1。

表1 不同糖源藍莓酒的考察指標Table 1 Examine indicators for blueberry wine of different sugar source

由表1可知，不同處理所得到的藍莓酒可溶性固形物、酒精度、甲醇、pH值、揮發(fā)酸、總酸、游離SO2和總SO2等指標均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》、GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》以及GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》中的要求。

蜂蜜藍莓酒的可溶性固形物含量較高，表明其酒體更加飽滿醇厚；調(diào)整發(fā)酵液糖度一致，蜂蜜藍莓酒的酒精度高于黃冰糖藍莓酒，這是由于酵母充分利用蜂蜜中的糖源，得到較高的轉(zhuǎn)換率，而不加糖藍莓酒由于糖分稀缺只得到了4%vol以內(nèi)的酒精度；3種藍莓酒的甲醇含量均符合國標要求，其中蜂蜜藍莓酒的含量低于黃冰糖藍莓酒；蜂蜜藍莓酒的pH值處于最低水平，這可能是因為蜂蜜中含有的有機酸向發(fā)酵液中轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致?lián)]發(fā)酸、總酸均處于較高水平，增加了酒的醇厚感；酒中揮發(fā)酸的含量可以檢測藍莓酒的發(fā)酵過程是否得當[24]，3種藍莓酒所測得的揮發(fā)酸含量均符合國標要求，表明發(fā)酵過程正常；游離SO2、總SO2指標在蜂蜜藍莓酒與黃冰糖藍莓酒中并無顯著差異（P>0.05）。蜂蜜藍莓酒色度值高于其他2個體系，這可能是因為蜂蜜中的類黃酮物質(zhì)得到有效浸提，穩(wěn)固藍莓酒的色澤度，且蜂蜜藍莓酒的感官評分處于最高水平，能夠帶來良好的風(fēng)味體驗。

2.3 不同糖源藍莓酒抗氧化物質(zhì)及抗氧化性測定結(jié)果比較

圖3為不同糖源藍莓酒抗氧化物質(zhì)及抗氧化性對比結(jié)果。

圖3 不同糖源藍莓酒抗氧化物質(zhì)及抗氧化性對比Fig.3 Antioxidant substance and antioxidant comparison of different sugar source of blueberry wine

酚類化合物是影響藍莓酒質(zhì)量的重要因素，賦予了藍莓酒獨特的感官品質(zhì)，其組成含量也與藍莓酒品質(zhì)密切相關(guān)。由圖3A可知，蜂蜜藍莓酒的總多酚、總黃酮、花青素含量最高，具有抗氧化作用，賦予果酒特殊的營養(yǎng)價值。蜂蜜藍莓酒中的酒精含量高，有利于酚類物質(zhì)的浸提[25]，因此蜂蜜藍莓酒的總多酚含量最高；總黃酮與酒體的感官品質(zhì)密切相關(guān)，能夠與花青素中花色苷物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成輻色效應(yīng)[26]，蜂蜜藍莓酒中的總黃酮含量最高，進而提高藍莓酒色澤的穩(wěn)定性；花青素主要存在于深色品種的藍莓果皮中，是藍莓酒呈色的主要化合物[27]，3種藍莓酒中蜂蜜藍莓酒的花青素含量最高。由圖3B可知，蜂蜜藍莓酒的抗氧化能力顯著高于其他2組（P＜0.05），這與其抗氧化物質(zhì)含量高有極大關(guān)聯(lián)。

2.4 不同藍莓酒指標的相關(guān)性分析

3種藍莓酒考察指標的相關(guān)系數(shù)見表2。

由表2可知，藍莓酒的可溶性固形物與酒精度、DPPH自由基清除率、感官評分呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；甲醇與游離SO2呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01）；pH值與揮發(fā)酸、總酸、總多酚、鐵離子還原能力、色度呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），與總黃酮呈極顯著負相關(guān)（P＜0.05）；揮發(fā)酸與總酸、DPPH自由基清除率、鐵離子還原能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；總酸與總多酚、總黃酮、鐵離子還原能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；總多酚與總黃酮、鐵離子還原能力、色度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；總黃酮與鐵離子還原能力、色度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；DPPH自由基清除率與感官評分呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。經(jīng)過相關(guān)性分析，藍莓酒各項考察指標之間存在獨立性也有著密切的相關(guān)性[28]，不同信息之間有著一定程度的重疊，為了提高對藍莓酒品質(zhì)指標評價的準確性，有必要通過主成分分析將其相關(guān)性指標歸類簡化。

2.5 主成分分析

通過主成分分析對不同發(fā)酵工藝所測指標進行降維，以特征值λ＞1為依據(jù)進行因子抽提，主成分特征值及其貢獻率見表3。圖4為不同發(fā)酵體系考察指標主成分分析。

表3 主成分特征值及其貢獻率Table 3 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

圖4 不同發(fā)酵體系考察指標主成分分析Fig.4 Analysis of main components of different fermentation systems

由表3可知，得到最優(yōu)的主成分數(shù)為2個，第一主成分的貢獻率為82.523%，第二主成分的貢獻率為14.317%，累計方差貢獻率達到96.840%，能夠有效地反映原數(shù)據(jù)的變異信息。

由圖4A可知，花青素、總多酚、總黃酮、色度、DPPH自由基清除率、鐵離子還原能力、總酸、揮發(fā)酸、可溶性固形物、酒精度與主成分 1（principal component 1，PC1）呈正相關(guān)，pH值與PC1呈負相關(guān)。游離SO2和總SO2與主成分 2（principal component 2，PC2）呈正相關(guān)。圖4B的得分圖可以發(fā)現(xiàn)其分布分散，說明這3種藍莓酒的各指標有較大差異，且同種糖源在同區(qū)域[29-30]。結(jié)合圖4A可知蜂蜜和藍莓組合發(fā)酵與總多酚、總黃酮、花青素、色度、總酸、揮發(fā)酸有較大聯(lián)系，表明該組合酚類物質(zhì)多，含有豐富有機酸，抗氧化性能更好。

為了更直觀地得出藍莓酒的綜合評價[31]，對兩個主成分所表達的信息進行數(shù)據(jù)化處理，計算公式如下，根據(jù)下式得到表4。

表4 不同藍莓酒成分得分及綜合排名Table 4 Scores and rankings of different blueberry wine

式中：Z為綜合得分；Y1、Y2為對應(yīng)主成分得分；X1～X15為各指標原始變量的標準變量。

由表4可知，蜂蜜藍莓酒3個樣品得分高，排在前3名，再結(jié)合主成分分析圖可知蜂蜜藍莓酒的酚類物質(zhì)及抗氧化性都很突出，整體呈色好，感官評分也最高，即品質(zhì)最好。

3 結(jié)論

本試驗以藍莓為原料，通過添加蜂蜜、黃冰糖和不加糖的3種工藝進行發(fā)酵處理，考察其理化指標，對比抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化性能。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3種工藝中蜂蜜和藍莓組合發(fā)酵方式最好，能夠得到11.60%vol的酒精度且適當?shù)目扇苄怨绦挝锟梢愿纳凭企w單薄現(xiàn)象，使其更加醇厚；蜂蜜藍莓酒的總酸、揮發(fā)酸含量最高且3種不同工藝之間表現(xiàn)出明顯差異，其中有機酸成分能夠為酒體帶來酸甜可口的典型風(fēng)味；蜂蜜藍莓酒的色澤品質(zhì)高于其他2種，是因為蜂蜜中的酚酸類物質(zhì)能夠增強顏色的穩(wěn)定性；總多酚、總黃酮、花青素含量均高于其他2種，DPPH自由基清除率和鐵離子還原能力測定的抗氧化性能均顯著高于其他2種。通過相關(guān)性分析和主成分分析可知各個指標之間存在相關(guān)性，其中酚類物質(zhì)和抗氧化性能參數(shù)密切相關(guān)，有效保證蜂蜜藍莓酒的營養(yǎng)物質(zhì)。綜上，蜂蜜和藍莓組合發(fā)酵能夠提升藍莓酒中酚類物質(zhì)的含量，提高其抗氧化性能，改善酒體色澤，且感官評分處于較高水平。本研究為今后推廣蜂蜜和藍莓的深加工提供新思路，為后續(xù)進一步優(yōu)化組合發(fā)酵工藝提供參考。