黃精速溶茶酶解工藝條件優化及其抗氧化性

王瑩，李鋒濤，黃美子，陳毓，盧軍鋒，錢建中

（江蘇農牧科技職業學院動物藥學院，江蘇 泰州 225300）

黃精（Polygonatum sibiricum）別名土靈芝，為百合科黃精屬多種植物的干燥塊莖，主要分布于北溫帶和北亞熱帶。黃精富含多糖、黃酮、生物堿、氨基酸等功能性成分，具有增強免疫功能、抑菌抗炎、降血糖、降血脂等功效，在食品、醫療等領域均具有良好的應用前景[1-4]。黃精是一種藥食同源類中藥材，常加入粥中熬制，也可蒸制后食用，除此之外，黃精還可加工為米酒、酸奶、發酵飲料等[5-8]。

速溶茶是在保證有效成分的基礎上，通過粉碎、浸提、過濾、濃縮和干燥等工藝過程，加工成的一種能夠迅速溶解的新型固體飲料，具有飲用方便、便于攜帶、容易保存等優點[9]。目前，已有關于青錢柳、桑椹、魚腥草等速溶茶產品的研究報道[10-12]，而黃精速溶茶的報道相對較少。念波等[13]以黃精為原料，乙醇為浸提劑，以乙醇體積分數、料液比為自變量，通過響應面法優化其工藝參數，得到的黃精速溶茶得率和多糖含量均較高，然而試驗中浸提劑乙醇的加入雖能促使有效成分溶出量增多，但也有可能改變有效成分的結構，從而影響效果。水煮中藥，其有效成分溶出量不多，但生物酶的加入有利于提高有效成分的溶出[14]。前期，課題組研究發現，復合酶（纖維素酶與果膠酶的質量比=1∶1）所得的黃精多糖得率遠高于單一酶法的黃精多糖得率，因此，為了進一步提高黃精速溶茶的得率，本試驗擬采用超聲輔助復合酶法浸提黃精速溶茶，考察液料比、加酶量、酶解溫度、酶解時間對黃精速溶茶得率的影響，通過響應曲面法確定最佳工藝條件，旨在為黃精的進一步開發和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精：江蘇中藥科技園，經江蘇農牧科技職業學院動物藥學院李鋒濤博士鑒定為黃精。

葡萄糖對照品：中國食品藥品檢定研究院；蘆丁：上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶（1.1×105U/g）、果膠酶（5×104U/g）：和氏璧生物科技有限公司；乙醇、硫酸、三氯化鋁（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800PC-DS2型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；LE204E電子天平：梅特勒-托利多有限公司；HH-1數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；HK-02A多功能粉碎機：上海燁昌食品機械有限公司；RE-52旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；TDL-5-A低速離心機：上海安亭科學儀器廠；GPW120-II噴霧干燥機：山東天力干燥股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃精預處理

黃精在60℃下真空干燥，經多功能粉碎機粉碎，過80目篩，所得黃精粉末密封貯藏，備用。

1.3.2 黃精速溶茶提取工藝

稱取黃精粉末10 g于具塞錐形瓶中，按照一定的液料比加入一定濃度的復合酶溶液，在一定溫度下以200W的超聲功率酶解一定時間，再過濾，濾液于100℃水浴1 h滅酶，重復3次，合并3次濾液，冷卻、減壓濃縮后，加入2%麥芽糊精，170℃噴霧干燥，得黃精速溶茶，根據下列公式計算黃精速溶茶得率。

1.3.3 酶解法提取工藝對黃精速溶茶得率的影響

1.3.3.1 單因素試驗

在加酶量1.5%（纖維素酶與果膠酶質量比=1∶1）、酶解溫度40℃、酶解時間30 min條件下，考察不同液料比[5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）]對黃精速溶茶得率的影響；在液料比20∶1（mL/g）、酶解溫度40℃、酶解時間30 min條件下，考察不同加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對黃精速溶茶得率的影響；在液料比20∶1（mL/g），加酶量1.5%（纖維素酶與果膠酶質量比=1∶1），酶解時間30 min條件下，考察不同酶解溫度（30、35、40、45、50℃）對黃精速溶茶得率的影響；在液料比20∶1（mL/g）、加酶量1.5%（纖維素酶與果膠酶質量比=1∶1）、酶解溫度40℃條件下，考察不同酶解時間（10、20、30、40、50 min）對黃精速溶茶得率的影響。每個試驗平行測定3次。

1.3.3.2 響應面優化黃精速溶茶生產工藝

根據單因素分析結果，以液料比（A）、加酶量（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）為自變量，以黃精速溶茶得率為響應值（Y），采用Box-Behnken試驗設計法進一步優化黃精速溶茶生產工藝。分析因素及水平見表1。

表1 響應面試驗分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 黃精速溶茶品質指標檢測

1.4.1 黃精多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定黃精多糖含量[15]，以葡萄糖濃度x為橫坐標，吸光度y為縱坐標，繪制標準曲線y=0.0109x+0.0918，R2=0.9993，在10.88μg/mL～50.82μg/mL范圍內，葡萄糖濃度與其吸光度具有良好線性關系。

根據下列公式計算多糖含量。

1.4.2 黃精中總黃酮含量測定

以蘆丁為標準品，采用三氯化鋁顯色法測定黃精中總黃酮含量[16]。蘆丁標準曲線為y=0.064 2x+0.165 8，R2=0.999 4，在 10.24 μg/mL～51.12 μg/mL 內，蘆丁濃度與其吸光度具有良好線性關系。根據下列公式計算黃精黃酮含量。

1.4.3 黃精速溶茶感官評價

取0.75 g黃精速溶茶，在自然光線下觀察色澤和外觀形態，分別取30、60、100℃的250 mL蒸餾水沖泡，觀察溶解性、滋味和氣味等變化，并進行評定。

1.5 黃精速溶茶抗氧化活性研究

1.5.1 DPPH自由基清除力測定

參照Shimada等[17]方法進行適當改進，配制4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg/mL 黃精速溶茶水溶液，精密移取1.00 mL不同濃度黃精速溶茶水溶液于比色管中，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液，置于暗處30 min，測定吸光度。以樣品溶劑為空白，測定其上清液在515 nm波長處吸光度A，同時測定在515 nm處樣品溶液吸光度A0及DPPH甲醇溶液吸光度A1[18]，平行測定3次，求平均值。按下式計算黃精速溶茶DPPH自由基清除率。

1.5.2 超氧陰離子自由基清除率測定

參照伏有為等[19]的方法進行適當改進，配制4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg/mL 黃精速溶茶水溶液，準確移取1.00 mL不同濃度的黃精速溶茶水溶液于比色管中，加入 4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）和2 mL 20 mmol/L鄰苯三酚溶液，水浴反應15 min，加入2 mL 1%HCl溶液，以蒸餾水為空白在325 nm處測定吸光度Ax，空白對照組吸光度A0，平行測定3次，求平均值。按下式計算黃精速溶茶超氧陰離子自由基清除率。

1.6 數據分析

利用Design-Expert 10.0.3軟件進行響應面分析，利用Microsoft Excel 2016進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對黃精速溶茶得率的影響

液料比對黃精速溶茶得率的影響見圖1。

圖1 液料比對黃精速溶茶得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖1可知，隨著液料比的增加，黃精速溶茶得率先升高后下降，當液料比為20∶1（mL/g）時，黃精速溶茶得率達到26.29%，這可能是由于隨著液料比的增加，黃精細胞內外濃度差增大，有利于多糖、黃酮等有效成分浸出，但當液料比過高時，可能減小了黃精有效成分與酶的接觸，影響黃精速溶茶的得率[18]。因此，后續響應面試驗液料比設置為20∶1（mL/g）。

2.1.2 加酶量對黃精速溶茶得率的影響

加酶量對黃精速溶茶得率的影響見圖2。

圖2 加酶量對黃精速溶茶得率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖2可知，當加酶量為0.5%～1.5%時，黃精速溶茶得率逐步增加，之后趨于穩定。這可能是由于隨著加酶量的增加，酶與黃精有效成分的結合點增多，加速細胞壁的溶解，有利于多糖、黃酮等有效成分的浸出。因此，后續加酶量選擇1.5%左右進行響應面試驗。

2.1.3 酶解溫度對黃精速溶茶得率的影響

酶解溫度對黃精速溶茶得率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對黃精速溶茶得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖3可知，隨著酶解溫度的上升，黃精速溶茶得率先上升，之后有所下降。這可能是因為溫度升高能夠促進酶解作用，且細胞內溶質分子的擴散速度也會加快，有利于多糖、黃酮等有效成分的溶出[20]，但當溫度超過45℃時，黃精速溶茶得率略微下降，這可能是因為每種酶都有最適宜的溫度，其中果膠酶和纖維素酶的最適溫度在40℃～50℃，故溫度過高，會影響酶解作用[21]。因此，后續酶解溫度選擇45℃左右進行響應面試驗。

2.1.4 酶解時間對黃精速溶茶得率的影響

酶解時間對黃精速溶茶得率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對黃精速溶茶得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖4可知，當酶解時間由10 min增加到40 min時，黃精速溶茶得率增加，之后略有下降。這是因為隨著酶解時間的延長，酶解反應逐漸進行完全，當酶解時間達到40 min時，黃精多糖、黃酮等有效成分浸出量最多，速溶茶得率達到最大。因此，后續酶解時間選擇40 min左右進行響應面試驗。

2.2 響應曲面試驗設計及結果

2.2.1 黃精速溶茶得率的數學模型建立

根據單因素分析結果，以液料比（A）、加酶量（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）為自變量，以黃精速溶茶得率為響應值（Y），采用Box-Behnken試驗設計法進行四因素三水平的響應面試驗結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface test

續表2 響應面試驗設計與結果Continue table 2 Design and results of response surface test

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

通過Design-Expert10.0.3軟件分析模型，擬合得到黃精速溶茶得率回歸方程：得率Y=27.49+2.04A+1.18B+0.34C+0.245D+0.44AB-0.46AC-0.43AD+0.46BC-0.035BD-0.24CD-4.51A2-2.18B2-2.36C2-1.35D2。

由表3可知，建立的模型具有較高的F值（38.13），較低的P值（P＜0.01），說明該模型極顯著，失擬項P=0.261 2＞0.05，不顯著，說明模型適合本試驗，可用于黃精速溶茶提取工藝優化。該模型相關系數R2=0.974 4，校正后系數R2Adj=0.948 9，說明該模型能解釋94.89%的響應變化。A、B、A2、B2、C2、D2對速溶茶得率影響差異極顯著（P＜0.01），由F值得到影響因素主次順序為A＞B＞C＞D，即液料比＞加酶量＞酶解溫度＞酶解時間。

2.2.2 黃精速溶茶工藝的響應面分析

黃精速溶茶工藝的響應面分析見圖5。

圖5 各因素交互影響黃精速溶茶得率的曲面圖Fig.5 Surface graph of factor interactions on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

響應面的陡峭程度反映了不同因素對黃精速溶茶得率的影響程度，響應面越陡，說明該因素對結果的影響越大，反之對試驗結果影響小[22]。由圖5可知，黃精速溶茶得率隨著液料比的增加，先急劇上升后下降，響應曲面最陡，說明液料比對黃精速溶茶得率影響最大，之后影響因素依次為加酶量、酶解溫度、酶解時間，與方差分析結果一致。

2.2.3 模型驗證

根據響應面法建立的模型預測黃精速溶茶最佳酶解工藝為液料比20.737∶1（mL/g）、加酶量1.369%、酶解溫度46.876℃、酶解時間37.373 min，此條件下，得率為26.82%，考慮實際操作的可控性，將上述最優酶解工藝修正為液料比21∶1（mL/g）、加酶量1.4%、酶解溫度47℃、酶解時間37 min。在此條件下進行驗證試驗，平行測定3次，黃精速溶茶平均得率為26.08%，與預測值26.82%較為接近，表明該模型能夠預測黃精速溶茶的提取工藝，模型可靠。

2.3 黃精速溶茶品質測定

2.3.1 感官評審

最佳酶解工藝條件下干燥后得到的黃精速溶茶，其感官評價見表4。

表4 黃精速溶茶感官評價Table 4 Sensory evaluation of Polygonatum sibiricum instant tea

2.3.2 不同沖泡溫度對黃精速溶茶溶解性影響

取0.75 g最佳酶解工藝條件下的黃精速溶茶，分別加入250 mL的30、60、100℃蒸餾水沖泡，沖泡溫度對黃精速溶茶溶解性的影響見表5。

表5 沖泡溫度對黃精速溶茶溶解性影響Table 5 Effect of brewing temperature on the solubility of Polygonatum sibiricum instant tea

2.3.3 理化指標測定結果

最佳酶解工藝條件下黃精速溶茶中的黃精多糖含量為3.73%，黃酮含量為0.95%。

2.4 黃精速溶茶抗氧化活性分析

黃精速溶茶對自由基的清除率見圖6。

圖6 黃精速溶茶對自由基的清除率Fig.6 Free radical scavenging rate of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖6可知，黃精速溶茶對DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，且清除率隨著黃精速溶茶濃度的增加而增大，之后趨于穩定，當黃精速溶茶濃度達到20.00 mg/mL時，其對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力分別達到62.18%和55.15%，黃精速溶茶對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的半清除率IC50分別為14.34 mg/mL和16.45 mg/mL。

3 討論與結論

浸提是速溶茶加工中最關鍵的工序之一，超聲輔助復合酶法具有浸提速度快、易于控制等優點，可實現有效活性成分高效提取。耿麗晶等[21]通過復合酶輔助法制備速溶普洱茶，得出最佳工藝參數為復合纖維素酶∶果膠酶∶蛋白酶=1∶1∶1，酶添加量為0.75%，酶解溫度為45℃，酶解60 min，茶水比為1∶12（g/mL），浸提2次，產品平均得率為26.23%。王家健等[23]比較了速溶茶酶法提取工藝和傳統沸水浸提工藝，結果表明酶法制備的速溶茶更多地保留了茶葉中的有效成分。

本試驗采用黃精做原料，利用超聲輔助復合酶法浸提制成黃精速溶茶，通過響應曲面法確定最佳工藝條件為液料比21∶1（mL/g）、加酶量1.4%、酶解溫度47℃、酶解時間37 min，此條件下，黃精速溶茶平均得率26.08%。所得產品為黃色粉末，在沸水中全部溶解，具有原藥材香味，微甜。該茶飲用方便，適合人們快節奏的生活方式。然而，本試驗所得黃精速溶茶的得率不高，這可能是由于速溶粉受潮導致粘壁。今后，將進一步研究速溶茶的最佳噴霧干燥技術，為黃精資源的開發開辟新途徑。