酪蛋白結(jié)構(gòu)特性及應(yīng)用研究進(jìn)展

劉晶晶，張薇，吳錦濤，劉洋，肖靜

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

酪蛋白（casein，CN）又稱(chēng)干酪素、酪朊和乳酪素，是一類(lèi)磷鈣結(jié)合型蛋白，對(duì)酸性環(huán)境敏感，在pH4.7左右時(shí)會(huì)發(fā)生聚沉，在母牛、羊、駱駝及人乳中約占總?cè)槌煞值?.75%，是哺乳動(dòng)物乳中含量最高、營(yíng)養(yǎng)功能最強(qiáng)的蛋白質(zhì)。酪蛋白分子結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，目前為止還沒(méi)有一個(gè)比較確定的分子式，其分子質(zhì)量大約在20 kDa～25 kDa，根據(jù)分子特性的不同可分為四類(lèi)，分別為αs1-CN、αs2-CN、β-CN和k-CN。酪蛋白能夠被蛋白酶分解為多種小分子生物活性肽，具有抗癌、抗微生物、抗高血壓、抗氧化、降低膽固醇、腸道調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)等功能[1]。本文綜述了酪蛋白的結(jié)構(gòu)特性、來(lái)源含量及應(yīng)用領(lǐng)域，以期為酪蛋白在各行業(yè)中的研究和廣泛應(yīng)用提供參考。

1 酪蛋白來(lái)源及含量

酪蛋白是哺乳動(dòng)物乳中最主要的蛋白質(zhì)，目前所用酪蛋白主要來(lái)源于一些較為常見(jiàn)且產(chǎn)量高、成本低的乳產(chǎn)品，如牛奶、羊奶等。在其他哺乳動(dòng)物乳如牦牛、駱駝及馬乳中，酪蛋白的含量也非常豐富，但價(jià)格較高。不同品種的乳中4種酪蛋白單體的比例也不相同。人乳中沒(méi)有α-CN，主要為β-CN，約占總酪蛋白含量的70%，還有小部分的k-CN，嬰幼兒主要通過(guò)人乳中的酪蛋白來(lái)獲取氨基酸和部分鈣、磷，同時(shí)酪蛋白在胃中會(huì)形成凝乳，凝乳更易于被嬰幼兒消化吸收[2-3]。酪蛋白主要來(lái)源及各單體含量見(jiàn)表1，4種酪蛋白單體分子量見(jiàn)表2。

表2 4種酪蛋白單體分子量Table 2 Molecular weight of four casein monomers

2 酪蛋白結(jié)構(gòu)

酪蛋白的4種亞基形式為αs1-CN、αs2-CN、β-CN和k-CN，這4種單體又以α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等形式組成了酪蛋白的空間結(jié)構(gòu)[4]。

2.1 酪蛋白空間結(jié)構(gòu)差異

不同品種乳中酪蛋白的結(jié)構(gòu)有所差異，李萌等[5]通過(guò)圓二色譜和紅外光譜相結(jié)合的方法研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于嬰幼兒來(lái)說(shuō)，羊奶β-CN比牛奶β-CN更易消化和吸收，主要原因?yàn)槎咧g結(jié)構(gòu)上的差異。通過(guò)圓二色譜測(cè)得羊乳β-CN和牛乳β-CN的三級(jí)結(jié)構(gòu)形式主要為無(wú)規(guī)則卷曲，羊乳β-CN的無(wú)規(guī)則卷曲含量明顯高于牛乳β-CN，而α-螺旋和β-折疊含量均明顯低于牛乳β-CN，β-轉(zhuǎn)角含量則無(wú)明顯差異。紅外光譜測(cè)得兩者三級(jí)結(jié)構(gòu)中羊乳β-CN的α-螺旋、β-折疊及β-轉(zhuǎn)角含量分別比牛乳β-CN低18%～20%、9%～10%、0.6%～1.0%，而無(wú)規(guī)卷曲含量比牛乳β-酪蛋白高17%～19%。利用分光光度法分析得出，位于羊乳β-CN和牛乳β-CN表面的巰基含量差異不明顯，但羊乳β-CN的總巰基含量明顯低于牛乳β-CN，羊乳β-CN和牛乳β-CN在接近等電點(diǎn)（pH4～5）時(shí)，溶解性降低，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)溶解性升高。在pH2～4和pH6～10時(shí)，羊乳β-CN溶解性高于牛乳β-CN，而在等電點(diǎn)時(shí)羊乳β-CN溶解性低于牛乳β-CN，羊乳β-CN分子與分子間的相互作用力更強(qiáng)，分子表面包含了更多的疏水基團(tuán)。

β-CN是人乳酪蛋白中最主要的酪蛋白成分，與牛乳β-CN相比，人乳β-CN三級(jí)結(jié)構(gòu)更加疏松，內(nèi)部包裹的巰基數(shù)量更少，導(dǎo)致膠束內(nèi)部三級(jí)結(jié)構(gòu)更為松散[1，5]。

2.2 酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)

酪蛋白以膠束的方式懸浮于水體系中，酪蛋白膠束由約20 000個(gè)酪蛋白分子組合而成，其結(jié)構(gòu)與普遍具有親水性頭部和疏水性尾部的膠束不同。礦物質(zhì)因子、αs-CN和β-CN共同構(gòu)成了酪蛋白膠束的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而k-CN覆蓋于酪蛋白膠束的表層，是酪蛋白膠束維持穩(wěn)定的重要因素之一。酪蛋白膠束的內(nèi)部含有大量水分子，每克蛋白平均要結(jié)合3 g～4 g水，這對(duì)于酪蛋白膠束內(nèi)部結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)是一個(gè)非常重要的特征。掃描電鏡觀察表明[4]，酪蛋白膠束的外部形狀結(jié)構(gòu)呈粗糙的球形，但酪蛋白膠束內(nèi)部結(jié)構(gòu)無(wú)法確定。目前研究者認(rèn)為酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)模型共有4個(gè)，分別為核-殼模型、雙結(jié)合模型、亞基模型和Holt結(jié)構(gòu)模型（又叫納米簇模型）。目前，人們普遍認(rèn)可的是Holt模型，該模型認(rèn)為酪蛋白膠束的內(nèi)部是由磷酸鈣與酪蛋白分子連接纏繞在一起而組成的微簇復(fù)合物，k-CN如同毛刷樣覆蓋于酪蛋白膠束的外層以維持其穩(wěn)定性。Holt模型綜合了上述各個(gè)模型的合理點(diǎn)，并且是通過(guò)小角X射線衍射測(cè)定及各種不同驗(yàn)證性試驗(yàn)后獲得[6]，因此是目前最為合理的結(jié)構(gòu)模型。

2.3 酪蛋白膠束穩(wěn)定性

2.3.1 k-CN對(duì)酪蛋白膠束穩(wěn)定性的影響

酪蛋白膠束的穩(wěn)定性由酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)決定，k-CN在酪蛋白膠束的穩(wěn)定性中起著關(guān)鍵作用。k-CN位于酪蛋白膠束的外層，具有兩性性質(zhì)，其疏水的尾部吸附于酪蛋白膠束內(nèi)部的其他蛋白分子上，而頭部向外突出形成親水殼，使酪蛋白膠束之間相互排斥。k-CN能夠使脯氨酸含量較高的酪蛋白依然呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的球狀模式。k-CN與αs1-CN和β-CN的不同之處在于，k-CN和αs2-CN都含有2個(gè)半胱氨酸殘基。因此，k-CN能夠在酪蛋白膠束表面之間形成二硫鍵多聚體，使膠束結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定[4，7]。

2.3.2 酸堿度對(duì)酪蛋白膠束的影響

不同環(huán)境因素對(duì)酪蛋白膠束的穩(wěn)定性也具有十分重要的影響，其中最主要的因素之一是pH值。研究人員在研究pH2～12時(shí)酪蛋白膠束的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)[7-8]，當(dāng)pH值在2～3及6～12時(shí)，酪蛋白分子開(kāi)始自發(fā)結(jié)合形成膠束，當(dāng)pH值在3～5.5時(shí)，酪蛋白分子開(kāi)始產(chǎn)生聚沉，此時(shí)為酪蛋白等電點(diǎn)。靜電相互作用、氫鍵及疏水相互作用對(duì)酪蛋白膠束構(gòu)成具有重要作用，在較低pH值（2.0～3.0）時(shí)酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)更為緊密，而在pH5.5～12條件下，酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)松弛，且膠束的半徑隨pH值的升高而增加。前者主要原因是疏水相互作用和氫鍵使酪蛋白膠束維持穩(wěn)定，而后者是因?yàn)閹ж?fù)電荷的酪蛋白分子互相排斥導(dǎo)致膠束結(jié)構(gòu)松弛。

2.3.3 高溫對(duì)酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

高溫會(huì)對(duì)酪蛋白顆粒間的氫離子和體系內(nèi)的鹽離子產(chǎn)生影響，能夠使酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的含量大大降低，而α-螺旋是蛋白質(zhì)中最穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)，因此高溫會(huì)對(duì)酪蛋白的穩(wěn)定性產(chǎn)生重要的影響[9-10]。

2.3.4 超高壓處理對(duì)酪蛋白穩(wěn)定性的影響

超高壓處理是指在100 MPa以上的壓力下處理食物樣品。采用超高壓處理能夠破壞酪蛋白的非共價(jià)鍵，當(dāng)在100 MPa～200 MPa處理時(shí)蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生可逆的變性，當(dāng)壓力在300 MPa以上時(shí)會(huì)使蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵產(chǎn)生不可逆的變性。超高壓會(huì)影響酪蛋白的結(jié)構(gòu)和功能從而改變其穩(wěn)定性[11]。Huppertz等[12]研究表明，酪蛋白在100 MPa～200 MPa的壓力下，其膠束無(wú)明顯變化，在250 MPa下處理15 min以后，酪蛋白的膠束團(tuán)明顯增大，在300 MPa～800 MPa下，酪蛋白的膠束結(jié)構(gòu)部分分解，膠束團(tuán)變小。

2.3.5 超聲處理對(duì)酪蛋白膠束的影響

超聲波是一種無(wú)法在真空中傳播的機(jī)械波，其波長(zhǎng)一般低于2 cm。經(jīng)過(guò)超聲處理的酪蛋白結(jié)構(gòu)表面原本的致密狀態(tài)變得松動(dòng)并出現(xiàn)片層，使酪蛋白的結(jié)構(gòu)松散。經(jīng)超聲處理后，酪蛋白膠束表面如毛刷狀覆蓋的k-CN片段會(huì)發(fā)生斷裂，因此經(jīng)超聲處理后的酪蛋白膠團(tuán)粒徑減小。另外經(jīng)試驗(yàn)證明，低頻超聲對(duì)酪蛋白膠束的破壞力要比高頻超聲大，被破壞的酪蛋白膠束之間結(jié)合成小的聚合體[13-15]。

3 酪蛋白的應(yīng)用

3.1 酪蛋白在食品中的應(yīng)用

3.1.1 生產(chǎn)嬰幼兒乳粉

酪蛋白含有8種必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，不需要預(yù)先進(jìn)行變性就能夠被酪蛋白酶水解。將酪蛋白應(yīng)用于嬰幼兒配方乳粉、食品，其易被嬰幼兒身體吸收，對(duì)于補(bǔ)充嬰幼兒身體所需營(yíng)養(yǎng)具有極重要的作用。由于β-CN是人母乳里最主要的蛋白質(zhì)成分，近年來(lái)人們開(kāi)始使用β-CN模擬嬰幼兒配方乳粉的蛋白質(zhì)組成，優(yōu)化嬰幼兒乳粉的蛋白質(zhì)組成和氨基酸比例，提升嬰幼兒配方乳粉的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[16-17]。

3.1.2 生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑

酪蛋白易與金屬離子尤其是鈣離子結(jié)合構(gòu)成可溶性復(fù)合物，能夠促使鈣離子在無(wú)維生素D參與下被腸壁細(xì)胞所吸收，因此酪蛋白可用作補(bǔ)鈣、鐵營(yíng)養(yǎng)的補(bǔ)充劑。對(duì)于愛(ài)好健身的人來(lái)說(shuō)，酪蛋白既能供給人體正常運(yùn)轉(zhuǎn)所需要的蛋白質(zhì)，又能夠很好地保護(hù)肌肉不受損傷和抗蛋白質(zhì)分解。此外酪蛋白還能夠在人體的血液中保存較長(zhǎng)的時(shí)間，因此，由酪蛋白制作的蛋白粉類(lèi)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑深受廣大健身愛(ài)好者的喜愛(ài)[18]。

3.1.3 肉類(lèi)產(chǎn)品加工

酪蛋白具有較多的磷酸基團(tuán)，具有吸濕性和持水性。在肉類(lèi)產(chǎn)品中酪蛋白能夠與肉中的蛋白質(zhì)復(fù)合吸收水分，從而增加肉制品的持水性、黏著力，提升肉類(lèi)產(chǎn)品品質(zhì)。另外，由于酪蛋白擁有非常穩(wěn)固的螯合系統(tǒng)，能夠與其他多種物質(zhì)相結(jié)合并賦予食品更好的質(zhì)地和口味，因此人們開(kāi)始利用酪蛋白與黃原膠經(jīng)熱處理后呈現(xiàn)的纖維樣結(jié)構(gòu)來(lái)模仿脂肪濕潤(rùn)嫩滑、乳膏狀的口感，從而代替某些特定人群飲食中的肉類(lèi)和脂類(lèi)食品[19]。

3.1.4 用作食品添加劑

根據(jù)酪蛋白類(lèi)型、螯合作用及較明顯的親水區(qū)和疏水區(qū)等，酪蛋白可作為良好的發(fā)泡劑和乳化劑，通過(guò)反應(yīng)時(shí)間、水分、pH值、溫度和催化劑的種類(lèi)等變化可以得到各種不一樣的風(fēng)味食品，如冰淇淋、乳飲料、西式糕點(diǎn)、餅干、面包、肉制品及水產(chǎn)肉糜制品等，可用作食品添加劑[20-21]。

3.1.5 生產(chǎn)食品保鮮膜

食品在儲(chǔ)存期間會(huì)發(fā)生顏色、氣味、味道等方面的改變，氧氣會(huì)對(duì)食品產(chǎn)生氧化降解作用導(dǎo)致食品變質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)大部分的包裝都是減少食品與氧氣之間的接觸，例如真空包裝等，能夠有效地減輕氧氣引起的降解反應(yīng)并延長(zhǎng)保質(zhì)期。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，基于涂膜保鮮技術(shù)制備的可食薄膜可以有效避免物質(zhì)遷移、實(shí)現(xiàn)機(jī)械性質(zhì)保護(hù)，并在不影響食品風(fēng)味的前提下保持其原有成分。酪蛋白能夠發(fā)生自我締合或與其他物質(zhì)發(fā)生締合作用，形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀聚合物結(jié)構(gòu)，且酪蛋白在高溫下較穩(wěn)定，因此酪蛋白生成的薄膜性能極佳，對(duì)食品的保質(zhì)期和風(fēng)味有很好的保障作用[22-25]。

3.2 酪蛋白在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用

3.2.1 用于藥物載體

酪蛋白的鰲合結(jié)構(gòu)可以很好地與其他物質(zhì)鰲合，促進(jìn)被鰲合物質(zhì)更好地吸收，并且能在特定靶向持續(xù)釋放。酪蛋白膠束和納米粒子已成功地應(yīng)用于多種疏水生物分子的納米包埋，如β-128胡蘿卜素、維生素D2、氟他胺、姜黃素、槲皮素等，具有較好的溶解性和保質(zhì)期[26-27]。Bindhya等[28]采用微波輔助法從大豆中提取出膳食異黃酮染料木素，并將藥物包封于牛奶酪蛋白載體后與孕酮結(jié)合，靶向表達(dá)于乳腺癌或卵巢癌細(xì)胞上的受體，使得載體載藥量?jī)?yōu)化至88.67%，提高了大豆提取物藥物對(duì)卵巢癌和三陰性乳腺癌細(xì)胞的抗癌活性方面的潛力。

3.2.2 制備生物活性肽

酪蛋白在親本蛋白質(zhì)序列中是一種無(wú)活性的狀態(tài)，利用蛋白水解酶水解掉酪蛋白特定肽鍵后，成為具有生物活性的多肽片段。這些活性肽多用作肽類(lèi)藥物或試劑，也可用于食品添加劑或功能性食品中，易被人體在小腸中吸收，具有極高的安全性，且酪蛋白資源豐富、價(jià)格便宜、易于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，酪蛋白來(lái)源的生物活性肽越來(lái)越受到人們的重視[29]。目前，人們已發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種具備生理性能的生物活性肽，如Mudgil等[30]使用堿性蛋白酶和鏈霉蛋白酶E處理牛和駱駝酪蛋白分別生成了牛乳和駱駝乳酪蛋白水解產(chǎn)物，用以模擬胃腸道消化后的有效水解物，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)胰脂肪酶和膽固醇酯酶的抑制均有顯著作用。抑制胰脂肪酶分泌是治療肥胖的有效方法，因此，駱駝乳和牛乳中的酪蛋白水解物具有開(kāi)發(fā)為新抗肥胖功能化合物的潛力。這些活性肽具有十分重要且普遍的生物學(xué)功能和調(diào)節(jié)功能，生物學(xué)和營(yíng)養(yǎng)功能為其大規(guī)模的生產(chǎn)提供廣闊的市場(chǎng)。對(duì)于大部分衍生自酪蛋白的生物活性肽，由于酪蛋白水解產(chǎn)物中活性肽的分離和純化難度較大，并且檢測(cè)方法和技術(shù)還尚未成熟，活性肽的生理機(jī)制暫不清楚，因此其工業(yè)化生產(chǎn)還存在一定困難[31-32]。

3.2.3 制備醫(yī)用止血?jiǎng)?/p>

出血是指嚴(yán)重創(chuàng)傷和創(chuàng)傷后受損血管的循環(huán)血量的喪失。理想的止血?jiǎng)┠苎杆僦寡?，不?huì)引起任何不良反應(yīng)?；谔烊痪酆衔锏募{米纖維材料具有很高的比表面積、較強(qiáng)的吸液能力、足夠的機(jī)械穩(wěn)定性，因此有利于開(kāi)發(fā)為止血?jiǎng)?。酪蛋白是生產(chǎn)抗凝劑和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin I-converting enzyme inhibitory，ACEI）的極好來(lái)源，酪蛋白水解物通過(guò)延長(zhǎng)凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）和活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）而顯示出強(qiáng)大的抗凝血活性，并具有較強(qiáng)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性[33]。Tu等[34]首次提出了一種制備自組裝納米纖維殼聚糖-酪蛋白聚電解質(zhì)復(fù)合物（polyelectrolyte complexes，PECs）新策略，利用聚合物之間的絡(luò)合作用來(lái)制造直徑非常小的納米纖維。由于直徑較小，殼聚糖-酪蛋白納米纖維提供了非常大的表面積與血液成分相互作用，并表現(xiàn)出色的凝血效率。此外，殼聚糖-酪蛋白PECs具有良好的血液相容性、無(wú)毒。同時(shí)，酪蛋白還有助于上皮細(xì)胞增殖和恢復(fù)上皮屏障的完整性（上皮恢復(fù)），增強(qiáng)止血?jiǎng)┑膫谟匣钚浴?/p>

3.3 酪蛋白在3D打印中的應(yīng)用

表面活性生物聚合物的應(yīng)用為3D可打印油墨提供了良好的機(jī)會(huì)和新的前景。理想的油墨必須表現(xiàn)出具有可恢復(fù)結(jié)構(gòu)的假塑性、黏彈性和觸變特性，以便以所需的印刷適性有效印刷[35]。Shahbazi等[36]將微晶纖維素通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單、可持續(xù)的乙酰化方法疏水改性。然后，將功能化的微晶纖維素加入到酪蛋白基乳劑中，取代部分脂肪，形成的Pickering乳液具有理想的假塑性、黏彈性、液滴大小、觸變特性和可逆的動(dòng)態(tài)基質(zhì)。因此，Pickering乳液形式的酪蛋白基油墨已顯示出可用于3D打印的可持續(xù)打印油墨的潛力。

4 展望

酪蛋白可以作為鈣、鐵及蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，能夠與其他物質(zhì)發(fā)生鰲合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)藥物緩釋?zhuān)哂辛己玫陌l(fā)泡、黏連、乳化和成膜特性，酪蛋白來(lái)源的生物活性肽還可應(yīng)用于自身免疫功能低下、移植排斥反應(yīng)和腫瘤等的治療，在食品和醫(yī)療等行業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越普遍。但酪蛋白膠束的內(nèi)部結(jié)構(gòu)人們目前尚不能確定，不同品種乳中的酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)和組成也存在較大差異，因此，人們還需要對(duì)不同乳源的酪蛋白膠束進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)、組成等方面的深入研究以及相應(yīng)檢測(cè)方法的改進(jìn)和創(chuàng)新，以便探討不同乳源酪蛋白膠束的形成機(jī)制和結(jié)構(gòu)差異。