黃芩素脂質(zhì)聚合物納米粒構(gòu)建及對(duì)腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫笞饔玫难芯?/h1>
2023-01-30 14:12:00劉峰項(xiàng)艷
浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志 2023年1期
劉 峰 項(xiàng) 艷
眩暈是常見的臨床癥狀，對(duì)于患者的身心健康具有潛在的危害[1-2]。循環(huán)缺血是引起眩暈的常見原因，被稱之為缺血性眩暈。長(zhǎng)期缺血性眩暈可導(dǎo)致腦部神經(jīng)細(xì)胞受損，甚至器質(zhì)性改變及持久性神經(jīng)功能障礙[3-4]。因此，有效預(yù)防或治療缺血性眩暈具有重要臨床價(jià)值。黃芩素是一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理作用[5-6]。近年研究顯示，黃芩素除在抗病毒、抗炎、抗癌等方面發(fā)揮積極作用外，還在腦缺血/再灌注損傷中起到保護(hù)作用[6]。脂質(zhì)聚合物納米粒（lipidpolymer hybrid nanoparticles，LPNs）是材料與制劑相結(jié)合的新型納米遞藥系統(tǒng)。LPNs 具有控釋、靶向遞送以及降低藥物毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[7]。近年來(lái)，多肽修飾的藥物，如靶向肽、穿膜肽、序列肽等，逐漸被重視。研究顯示，TAT 短肽修飾的藥物易通過血腦屏障[8]。本研究通過構(gòu)建TAT 短肽修飾的載黃芩素脂質(zhì)聚合物納米粒（TAT modified baicalein-loaded lipid polymer nanoparticles，Bai-TAT-LPNs），觀察其對(duì)腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫蟮淖饔茫瑸榕R床提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 動(dòng) 物 健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠80 只，由杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0004。合格證號(hào)：No.20200809 Abzz01050 00595。大鼠飼養(yǎng)在清潔級(jí)動(dòng)物房中，12h 照明/12 h黑暗，溫度26～28 ℃，濕度40%～60%，自由飲水?dāng)z食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核（批準(zhǔn)文號(hào)：20200619）。
1.2 主要試劑 黃芩素（20 mg/支；批號(hào)20200725）購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；TAT 穿膜肽購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物；合成磷脂（DSPE-mPEG2000）（批號(hào)N1416）購(gòu)自西安瑞禧生物；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號(hào)H1735）購(gòu)自美國(guó)santa 公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自欣博盛生物。乳酸（lactic acid，LAC）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成公司。
1.3 主要儀器 RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州華辰）；H1850R 超速低溫離心機(jī)（湖南湘儀）；小鼠跳臺(tái)記錄儀（上海艾研）；CX23 正置顯微鏡（日本奧林巴斯）；VMR 小動(dòng)物麻醉機(jī)（美國(guó)Matrx）；透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）；BV-520T 激光多普勒血流儀（深圳貝斯曼精密儀器）；MR-96A 酶標(biāo)儀（深圳邁瑞）；粒徑分析儀（丹東百特儀器）。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 Bai-TAT-LPNs 的制備 Bai-TAT-LPNs 的制備采用納米沉淀法。制備水相：制備100 mg/mL 的DSPE-mPEG2000 乙醇溶液500 μL，溶解于去離子水中。制備油相：10 mg Bai 和120 mg 聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶解于20 mL 乙腈中。將油相混入水相中，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙腈，0.8 μm 濾膜過濾即得LPNs。向LPNs 中加入1 mL TAT，4 ℃、100 r/min 孵育過夜，而后采用瓊脂糖凝膠CL-4B 柱去除游離TAT，去離子水洗脫，所得液體即為Bai-TAT-LPNs。
2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組、給藥及跳臺(tái)反射訓(xùn)練 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以簡(jiǎn)單隨機(jī)分組法分為假手術(shù)組、模型組、Bai 組、Bai-TAT-LPNs 組，模型大鼠構(gòu)建方法見2.3。每組最終篩選8 只合格大鼠入組。Bai 組和Bai-TAT-LPNs組以腹腔注射給予Bai 當(dāng)量為100 mg/kg，模型組給予等體積生理鹽水進(jìn)行對(duì)照。每天給藥1 次，共給藥5 d。跳臺(tái)反射訓(xùn)練時(shí)間為每次給藥后2 h。設(shè)置刺激電壓和時(shí)長(zhǎng)分別為32 V 和5 min。每次訓(xùn)練時(shí)大鼠應(yīng)適應(yīng)測(cè)試環(huán)境5 min。檢測(cè)記錄跳臺(tái)潛伏期（step down latency，SDL）。
2.3 腦缺血眩暈?zāi)Ｐ痛笫髽?gòu)建 最后一次給藥前，大鼠采用異氟烷麻醉。手術(shù)方法：鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和鎖骨下動(dòng)脈并穿線結(jié)扎，最終縫合皮膚。模型組、Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組通過手術(shù)結(jié)扎頸總動(dòng)脈和鎖骨下動(dòng)脈，假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)而不進(jìn)行結(jié)扎處理。隨后進(jìn)行給藥，給藥后1 h 后采用離心機(jī)對(duì)大鼠進(jìn)行眩暈處理，眩暈30 s 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.4 各組大鼠前庭神經(jīng)核組織血流量檢測(cè) 以激光多普勒血流儀檢測(cè)各組大鼠正常血流量曲線，而后將備用線結(jié)扎血管（除假手術(shù)組），記錄第5～30 min血流量值，計(jì)算前庭神核組織血流量降率。
2.5 各組大鼠LAC、LDH、SOD 及MDA 檢測(cè) 取各組大鼠右側(cè)腦組織0.2 g，加入1.2 mL 生理鹽水，放入研磨球后間歇性勻漿15 s，將勻漿液以3000 r/min離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，參照LAC、LDH、MDA、SOD 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各指標(biāo)水平。
2.6 各組大鼠腦組織BDNF 蛋白表達(dá)檢測(cè) 解剖大鼠顱腦，分離大腦海馬CA1 區(qū)組織，各組大鼠組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后制成切片。切片經(jīng)水化、去除內(nèi)源性過氧化氫酶、封閉等步驟，后依次孵育腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（BDNF）抗體（1∶1000）、二抗、色源底物，脫水后以中性樹脂進(jìn)行封片，拍照記錄組織BDNF 染色情況。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量組織切片的平均光密度（integrated optical density，IOD）值。
2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)軟件為SPSS 14.0。多組間比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 結(jié)果
3.1 Bai-TAT-LPNs 的表征 Bai-TAT-LPNs 的平均粒徑為（127±2.6）nm（見圖1A）。Bai-TAT-LPNs 外觀呈均一的球形（見圖1B）。
3.2 各組大鼠SDL 比較 模型組大鼠SDL 較假手術(shù)組明顯增加（P＜0.01）；Bai 或Bai-TAT-LPNs 治療能有效縮短模型大鼠SDL（P＜0.01），且Bai-TAT-LPNs 治療效果優(yōu)于Bai（P＜0.01），見表1。
表1 各組大鼠SDL 比較（s，）
表1 各組大鼠SDL 比較（s，）
注：Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組腹腔注射Bai 100 mg/kg；模型組給予等體積生理鹽水；SDL 為跳臺(tái)潛伏期；Bai 為黃芩素；Bai-TAT-LPNs為TAT 修飾的載黃芩素脂質(zhì)聚合物納米粒；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與Bai 組比較，cP＜0.01
3.3 各組大鼠前庭神經(jīng)核血流量比較 5～30 min 檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，模型組較假手術(shù)組前庭神經(jīng)核組織血流量顯著下降（P 均＜0.01）；Bai 或Bai-TAT-LPNs 治療均可一定程度升高模型大鼠前庭神經(jīng)核組織血流量，且Bai-TAT-LPNs 效果優(yōu)于Bai（P 均＜0.01），見表2。
表2 各組大鼠前庭神經(jīng)核血流量比較（%，）
表2 各組大鼠前庭神經(jīng)核血流量比較（%，）
注：Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組腹腔注射Bai 100 mg/kg；模型組給予等體積生理鹽水；Bai 為黃芩素；Bai-TAT-LPNs 為TAT 修飾的載黃芩素脂質(zhì)聚合物納米粒；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與Bai 組比較，cP＜0.01
3.4 各組大鼠腦組織LAC、LDH、SOD 及MDA 比較與假手術(shù)組比較，腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫驦AC、MDA 及LDH 含量增加，SOD 含量下降（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，Bai-TAT-LPNs 組LAC、MDA及LDH 含量顯著降低，SOD含量升高（P＜0.05 或P＜0.01）。Bai-TAT-LPNs 組LDH 和SOD 含量較Bai 組差異顯著（P＜0.05），見表3。
表3 各組大鼠LAC、LDH、SOD 及MDA 水平（）
表3 各組大鼠LAC、LDH、SOD 及MDA 水平（）
注：Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組腹腔注射Bai 100 mg/kg，模型組給予等體積生理鹽水；Bai 為黃芩素；Bai-TAT-LPNs 為TAT 修飾的載黃芩素脂質(zhì)聚合物納米粒；LAC 為乳酸；LDH 為乳酸脫氫酶、MDA 為丙二醛；SOD 為超氧化物歧化酶；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與Bai 組比較，eP＜0.05
3.5 各組大鼠腦組織BDNF 蛋白表達(dá)比較 假手術(shù)組、模型組、Bai 組、Bai-TAT-LPNs 組BDNF 蛋白平均IOD 值分別為（3252.25±396.60）、（2889.58±525.6）、（6612.18±896.62）、（9256.66±958.68）。Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組較模型組BDNF 蛋白平均IOD 值均顯著升高（P＜0.01）；與Bai 組比較，Bai-TAT-LPNs 組BDNF 蛋白平均IOD 值明顯升高（P＜0.01），見圖2。
圖2 各組大鼠腦組織BDNF 蛋白表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，200×）
4 討論
本研究將TAT 修飾的LPNs 載藥系統(tǒng)成功包載Bai 制備出Bai-TAT-LPNs。LPNs 載藥系統(tǒng)在緩釋藥物、提高療效和降低毒性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[9]。而對(duì)納米粒子表面進(jìn)行功能性修飾，可進(jìn)一步增強(qiáng)藥物療效，如TAT 修飾藥物具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力，易通過血腦屏障[8，10-11]。提示，Bai-TAT-LPNs 可能具有更高的藥效以及較低的毒性。
為了觀察Bai-TAT-LPNs 對(duì)腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫蟮淖饔茫狙芯客ㄟ^手術(shù)結(jié)扎大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈和鎖骨下動(dòng)脈，并通過離心機(jī)眩暈處理構(gòu)建缺血性眩暈大鼠模型。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型大鼠的SDL增加，前庭核血流量降低。前庭是機(jī)體平衡的重要作用系統(tǒng)，其缺血會(huì)導(dǎo)致前庭功能紊亂而引起眩暈[12]。而SDL 是反映模型大鼠眩暈程度的重要行為學(xué)指標(biāo)[12]。這些結(jié)果提示，缺血性眩暈大鼠模型構(gòu)建成功。通過Bai-TAT-LPNs 治療模型大鼠發(fā)現(xiàn)，Bai-TAT-LPNs 能明顯縮短SDL，增加前庭血流量，且效果優(yōu)于Bai。表明，TAT-LPNs 增強(qiáng)了Bai 對(duì)腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫蟮寞熜АＭǔＧ闆r下，腦缺血缺氧可引起大量的過氧化物產(chǎn)生，并且機(jī)體不易將過氧化產(chǎn)物清除[13]。過多的過氧化產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞通透性增加，最終引起氧化損傷[14]。文獻(xiàn)顯示，缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫竽X組織過氧化產(chǎn)物（LDH、LAC 和MDA）和氧自由基清除物（SOD）異常[3，12]。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫竽X組織LDH、LAC 和MDA 含量增加，而SOD 含量降低。Bai 和Bai-TAT-LPNs 均可逆轉(zhuǎn)LAC、MDA、LDH 和SOD 變化，且Bai-TAT-LPNs 作用更為明顯。提示TAT-LPNs 增強(qiáng)了Bai 對(duì)缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫竽X部氧化損傷的保護(hù)作用。
腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF 廣泛存在于機(jī)體的組織細(xì)胞中，它通過與酪氨酸激酶B 結(jié)合而發(fā)揮作用[15]。研究已證實(shí)，大腦海馬組織BDNF 表達(dá)與大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)[15]。而在本研究中，缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫蟠竽X海馬C1 區(qū)組織BDNF 弱表達(dá)，而Bai 和Bai-TAT-LPNs 治療后分別表達(dá)升高，尤其Bai-TAT-LPNs 組。提示Bai 和Bai-TAT-LPNs 可能通過上調(diào)BDNF 表達(dá)而增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，而該作用可能與改善SDL 變化有關(guān)。
總之，Bai-TAT-LPNs 對(duì)腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫缶哂休^好的預(yù)防或治療作用，該作用可能與增加前庭核血流量、降低氧化損傷及上調(diào)腦海馬組織BDNF蛋白表達(dá)有關(guān)。
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1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 動(dòng) 物 健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠80 只，由杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0004。合格證號(hào)：No.20200809 Abzz01050 00595。大鼠飼養(yǎng)在清潔級(jí)動(dòng)物房中，12h 照明/12 h黑暗，溫度26～28 ℃，濕度40%～60%，自由飲水?dāng)z食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核（批準(zhǔn)文號(hào)：20200619）。
1.2 主要試劑 黃芩素（20 mg/支；批號(hào)20200725）購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；TAT 穿膜肽購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物；合成磷脂（DSPE-mPEG2000）（批號(hào)N1416）購(gòu)自西安瑞禧生物；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號(hào)H1735）購(gòu)自美國(guó)santa 公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自欣博盛生物。乳酸（lactic acid，LAC）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成公司。
1.3 主要儀器 RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州華辰）；H1850R 超速低溫離心機(jī)（湖南湘儀）；小鼠跳臺(tái)記錄儀（上海艾研）；CX23 正置顯微鏡（日本奧林巴斯）；VMR 小動(dòng)物麻醉機(jī)（美國(guó)Matrx）；透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）；BV-520T 激光多普勒血流儀（深圳貝斯曼精密儀器）；MR-96A 酶標(biāo)儀（深圳邁瑞）；粒徑分析儀（丹東百特儀器）。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 Bai-TAT-LPNs 的制備 Bai-TAT-LPNs 的制備采用納米沉淀法。制備水相：制備100 mg/mL 的DSPE-mPEG2000 乙醇溶液500 μL，溶解于去離子水中。制備油相：10 mg Bai 和120 mg 聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶解于20 mL 乙腈中。將油相混入水相中，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙腈，0.8 μm 濾膜過濾即得LPNs。向LPNs 中加入1 mL TAT，4 ℃、100 r/min 孵育過夜，而后采用瓊脂糖凝膠CL-4B 柱去除游離TAT，去離子水洗脫，所得液體即為Bai-TAT-LPNs。
2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組、給藥及跳臺(tái)反射訓(xùn)練 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以簡(jiǎn)單隨機(jī)分組法分為假手術(shù)組、模型組、Bai 組、Bai-TAT-LPNs 組，模型大鼠構(gòu)建方法見2.3。每組最終篩選8 只合格大鼠入組。Bai 組和Bai-TAT-LPNs組以腹腔注射給予Bai 當(dāng)量為100 mg/kg，模型組給予等體積生理鹽水進(jìn)行對(duì)照。每天給藥1 次，共給藥5 d。跳臺(tái)反射訓(xùn)練時(shí)間為每次給藥后2 h。設(shè)置刺激電壓和時(shí)長(zhǎng)分別為32 V 和5 min。每次訓(xùn)練時(shí)大鼠應(yīng)適應(yīng)測(cè)試環(huán)境5 min。檢測(cè)記錄跳臺(tái)潛伏期（step down latency，SDL）。
2.3 腦缺血眩暈?zāi)Ｐ痛笫髽?gòu)建 最后一次給藥前，大鼠采用異氟烷麻醉。手術(shù)方法：鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和鎖骨下動(dòng)脈并穿線結(jié)扎，最終縫合皮膚。模型組、Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組通過手術(shù)結(jié)扎頸總動(dòng)脈和鎖骨下動(dòng)脈，假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)而不進(jìn)行結(jié)扎處理。隨后進(jìn)行給藥，給藥后1 h 后采用離心機(jī)對(duì)大鼠進(jìn)行眩暈處理，眩暈30 s 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.4 各組大鼠前庭神經(jīng)核組織血流量檢測(cè) 以激光多普勒血流儀檢測(cè)各組大鼠正常血流量曲線，而后將備用線結(jié)扎血管（除假手術(shù)組），記錄第5～30 min血流量值，計(jì)算前庭神核組織血流量降率。
2.5 各組大鼠LAC、LDH、SOD 及MDA 檢測(cè) 取各組大鼠右側(cè)腦組織0.2 g，加入1.2 mL 生理鹽水，放入研磨球后間歇性勻漿15 s，將勻漿液以3000 r/min離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，參照LAC、LDH、MDA、SOD 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各指標(biāo)水平。
2.6 各組大鼠腦組織BDNF 蛋白表達(dá)檢測(cè) 解剖大鼠顱腦，分離大腦海馬CA1 區(qū)組織，各組大鼠組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后制成切片。切片經(jīng)水化、去除內(nèi)源性過氧化氫酶、封閉等步驟，后依次孵育腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（BDNF）抗體（1∶1000）、二抗、色源底物，脫水后以中性樹脂進(jìn)行封片，拍照記錄組織BDNF 染色情況。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量組織切片的平均光密度（integrated optical density，IOD）值。
2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)軟件為SPSS 14.0。多組間比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 結(jié)果
3.1 Bai-TAT-LPNs 的表征 Bai-TAT-LPNs 的平均粒徑為（127±2.6）nm（見圖1A）。Bai-TAT-LPNs 外觀呈均一的球形（見圖1B）。
3.2 各組大鼠SDL 比較 模型組大鼠SDL 較假手術(shù)組明顯增加（P＜0.01）；Bai 或Bai-TAT-LPNs 治療能有效縮短模型大鼠SDL（P＜0.01），且Bai-TAT-LPNs 治療效果優(yōu)于Bai（P＜0.01），見表1。
表1 各組大鼠SDL 比較（s，）
表1 各組大鼠SDL 比較（s，）
注：Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組腹腔注射Bai 100 mg/kg；模型組給予等體積生理鹽水；SDL 為跳臺(tái)潛伏期；Bai 為黃芩素；Bai-TAT-LPNs為TAT 修飾的載黃芩素脂質(zhì)聚合物納米粒；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與Bai 組比較，cP＜0.01
3.3 各組大鼠前庭神經(jīng)核血流量比較 5～30 min 檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，模型組較假手術(shù)組前庭神經(jīng)核組織血流量顯著下降（P 均＜0.01）；Bai 或Bai-TAT-LPNs 治療均可一定程度升高模型大鼠前庭神經(jīng)核組織血流量，且Bai-TAT-LPNs 效果優(yōu)于Bai（P 均＜0.01），見表2。
表2 各組大鼠前庭神經(jīng)核血流量比較（%，）
表2 各組大鼠前庭神經(jīng)核血流量比較（%，）
注：Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組腹腔注射Bai 100 mg/kg；模型組給予等體積生理鹽水；Bai 為黃芩素；Bai-TAT-LPNs 為TAT 修飾的載黃芩素脂質(zhì)聚合物納米粒；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與Bai 組比較，cP＜0.01
3.4 各組大鼠腦組織LAC、LDH、SOD 及MDA 比較與假手術(shù)組比較，腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫驦AC、MDA 及LDH 含量增加，SOD 含量下降（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，Bai-TAT-LPNs 組LAC、MDA及LDH 含量顯著降低，SOD含量升高（P＜0.05 或P＜0.01）。Bai-TAT-LPNs 組LDH 和SOD 含量較Bai 組差異顯著（P＜0.05），見表3。
表3 各組大鼠LAC、LDH、SOD 及MDA 水平（）
表3 各組大鼠LAC、LDH、SOD 及MDA 水平（）
注：Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組腹腔注射Bai 100 mg/kg，模型組給予等體積生理鹽水；Bai 為黃芩素；Bai-TAT-LPNs 為TAT 修飾的載黃芩素脂質(zhì)聚合物納米粒；LAC 為乳酸；LDH 為乳酸脫氫酶、MDA 為丙二醛；SOD 為超氧化物歧化酶；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與Bai 組比較，eP＜0.05
3.5 各組大鼠腦組織BDNF 蛋白表達(dá)比較 假手術(shù)組、模型組、Bai 組、Bai-TAT-LPNs 組BDNF 蛋白平均IOD 值分別為（3252.25±396.60）、（2889.58±525.6）、（6612.18±896.62）、（9256.66±958.68）。Bai 組和Bai-TAT-LPNs 組較模型組BDNF 蛋白平均IOD 值均顯著升高（P＜0.01）；與Bai 組比較，Bai-TAT-LPNs 組BDNF 蛋白平均IOD 值明顯升高（P＜0.01），見圖2。
圖2 各組大鼠腦組織BDNF 蛋白表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，200×）
4 討論
本研究將TAT 修飾的LPNs 載藥系統(tǒng)成功包載Bai 制備出Bai-TAT-LPNs。LPNs 載藥系統(tǒng)在緩釋藥物、提高療效和降低毒性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[9]。而對(duì)納米粒子表面進(jìn)行功能性修飾，可進(jìn)一步增強(qiáng)藥物療效，如TAT 修飾藥物具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力，易通過血腦屏障[8，10-11]。提示，Bai-TAT-LPNs 可能具有更高的藥效以及較低的毒性。
為了觀察Bai-TAT-LPNs 對(duì)腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫蟮淖饔茫狙芯客ㄟ^手術(shù)結(jié)扎大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈和鎖骨下動(dòng)脈，并通過離心機(jī)眩暈處理構(gòu)建缺血性眩暈大鼠模型。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型大鼠的SDL增加，前庭核血流量降低。前庭是機(jī)體平衡的重要作用系統(tǒng)，其缺血會(huì)導(dǎo)致前庭功能紊亂而引起眩暈[12]。而SDL 是反映模型大鼠眩暈程度的重要行為學(xué)指標(biāo)[12]。這些結(jié)果提示，缺血性眩暈大鼠模型構(gòu)建成功。通過Bai-TAT-LPNs 治療模型大鼠發(fā)現(xiàn)，Bai-TAT-LPNs 能明顯縮短SDL，增加前庭血流量，且效果優(yōu)于Bai。表明，TAT-LPNs 增強(qiáng)了Bai 對(duì)腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫蟮寞熜АＭǔＧ闆r下，腦缺血缺氧可引起大量的過氧化物產(chǎn)生，并且機(jī)體不易將過氧化產(chǎn)物清除[13]。過多的過氧化產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞通透性增加，最終引起氧化損傷[14]。文獻(xiàn)顯示，缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫竽X組織過氧化產(chǎn)物（LDH、LAC 和MDA）和氧自由基清除物（SOD）異常[3，12]。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫竽X組織LDH、LAC 和MDA 含量增加，而SOD 含量降低。Bai 和Bai-TAT-LPNs 均可逆轉(zhuǎn)LAC、MDA、LDH 和SOD 變化，且Bai-TAT-LPNs 作用更為明顯。提示TAT-LPNs 增強(qiáng)了Bai 對(duì)缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫竽X部氧化損傷的保護(hù)作用。
腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF 廣泛存在于機(jī)體的組織細(xì)胞中，它通過與酪氨酸激酶B 結(jié)合而發(fā)揮作用[15]。研究已證實(shí)，大腦海馬組織BDNF 表達(dá)與大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)[15]。而在本研究中，缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫蟠竽X海馬C1 區(qū)組織BDNF 弱表達(dá)，而Bai 和Bai-TAT-LPNs 治療后分別表達(dá)升高，尤其Bai-TAT-LPNs 組。提示Bai 和Bai-TAT-LPNs 可能通過上調(diào)BDNF 表達(dá)而增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，而該作用可能與改善SDL 變化有關(guān)。
總之，Bai-TAT-LPNs 對(duì)腦缺血性眩暈?zāi)Ｐ痛笫缶哂休^好的預(yù)防或治療作用，該作用可能與增加前庭核血流量、降低氧化損傷及上調(diào)腦海馬組織BDNF蛋白表達(dá)有關(guān)。
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