基于網絡藥理學及分子對接探究胎元飲治療先兆流產的作用機制※

黎佩茹 林朗華 何思雅 潘美均 吳愛華,2 梁雪芳,3△

(1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省中醫院生殖醫學科，廣東 廣州 510000；3.廣東省中醫院婦科，廣東 廣州 510000)

先兆流產是最常見的妊娠并發癥，發病率為15%～20%，并且發生率呈逐年上升趨勢[1-2]，對婦女的身體、心理健康造成嚴重影響。先兆流產若未得到及時治療，約10%～15%的患者可發展為難免流產[3]。先兆流產的病因復雜，涉及因素繁多，且其相關發病機制尚未完全闡明，西醫治療一般采用適當休息、禁止性生活，同時予人絨毛膜促性腺激素、孕激素等藥物治療[4]。先兆流產屬中醫學“胎漏”“胎動不安”范疇。中醫藥治療先兆流產臨床療效顯著，不良反應少[1]。中醫學認為，氣虛胎失所載，血虛胎失所養，氣血虛弱，沖任失養，胎氣不固，故見胎漏或胎動不安[5]，氣血虛弱是先兆流產的重要病機。胎元飲出自張景岳所著《景岳全書》，具有補氣養血、固腎安胎之功，主治氣血虛弱型胎漏、胎動不安，是中醫臨床治療先兆流產的經典方劑[5-6]。

網絡藥理學對“藥物-成分-靶點-疾病”的相互作用關系進行分析，并對藥物的作用機制進行預測，為將中醫從經驗醫學轉化為循證醫學體系提供了新的研究方法，是近年來中醫藥研究的新方法[7-8]。因此，本研究基于網絡藥理學和分子對接技術對胎元飲治療先兆流產的主要活性成分及核心靶點等進行預測、分析，探討胎元飲治療先兆流產的作用機制，以為臨床推廣提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 胎元飲有效成分及相關作用靶點篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmsp-e.com/)[9]，分別以胎元飲中的8味中藥“白芍”“白術”“陳皮”“當歸”“杜仲”“甘草”“人參”“熟地黃”為關鍵詞進行檢索，然后根據藥物藥動學特征[口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18]，篩選出胎元飲的有效活性成分及其作用的蛋白質靶點，并根據目前已發表的文獻報道來補充未預測到的有效活性成分的已知靶點。然后利用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org)選取已被驗證的人類蛋白，將靶點進行標準化處理，以獲取基因名。

1.2 先兆流產相關靶點篩選 以“threatened abortion” “threatened miscarriage”為關鍵詞，在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、DrugBank數據庫(https://www.drugbank.com/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)、PharmGKB數據庫(https://www.pharmgkb.org/)、TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd)中檢索先兆流產的相關靶點，最后合并5個數據庫靶點，并刪除重復值，獲得先兆流產疾病相關靶點。

1.3 “藥物-疾病”交集靶點獲取 利用R語言(R i386 4.0.5)將胎元飲有效活性成分靶點與先兆流產疾病相關靶點取交集并繪制韋恩圖。

1.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建及分析 將以上步驟得到的藥物有效活性成分、有效活性成分對應的靶點、“藥物-疾病”交集靶點的數據整合，運用 Cytoscape 3.7.2軟件構建 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，并利用Cytoscape 3.7.2 軟件中“Network Analyzer”的功能，計算出不同節點的度(Degree)值，Degree值越大，節點面積越大，表示該節點的生物功能越重要。根據 Degree 值由大到小排序，篩選前3位作為胎元飲的主要活性成分。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及分析 將“藥物-疾病”交集靶點提交至STRING 11.0數據庫(https://string-db.org)構建PPI網絡模型[10]，將生物種類設定為“Homo sapiens”，參數設置均為默認設置。將獲得的PPI網絡導入Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI網絡圖，并使用Cytoscape 3.7.2軟件中CytoNCA插件的初始網絡節點的中介中心性(betweenness centrality, BC)、緊密中心性(closeness centrality, CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality, EC)、度中心性(degree centrality，DC)、局部平均連通性(local average connectivity-based method, LAC)、網絡中心性(network centrality, NC)等拓撲學參數的中位數作為篩選依據進行1次篩選以精簡網絡。最后再利用Cytoscape 3.7.2軟件中的MCODE 1.6.1插件，根據該插件默認參數 “degree cutoff ≥2, node score cutoff≥0.2,K-score≥2, maximum depth=100”得到不同的靶點團[11]，選取分數(score)最高的靶點團作為胎元飲治療先兆流產的核心靶點團。其中，MCODE score 可反映單個節點與其周圍節點的緊密程度[12]，將靶點團中MCODE score 排名前3的靶點作為胎元飲治療先兆流產的核心靶點。

1.6 “藥物-疾病”交集靶點基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 運用R語言(R i386 4.0.5)將“藥物-疾病”交集靶點的基因名轉換為Entrez ID，并將ClusterProfiler、DOSE、enrichplot等軟件包安裝至R軟件中，通過運行ClusterProfiler進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，按P值由小到大排序，分別篩選出排名前10的條目繪制GO功能富集分析氣泡圖，排名前30的通路制作KEGG通路富集分析條形圖。其中，GO功能包括生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)及分子功能(molecular function, MF)。

1.7 分子對接驗證 將篩選得到的胎元飲主要活性成分與PPI網絡分析得到的核心靶點進行分子對接驗證。首先從PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載PPI網絡中核心靶點PDB格式的3D結構，通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取主要活性成分的sdf結構，并通過OpenBabel轉換成PDB文件；再運用AutoDock Tools 1.5.6軟件對蛋白質靶點進行去水、加氫等操作，并將活性成分及靶蛋白格式轉換為pdbqt格式；最后通過 AutoDock Vina 進行分子對接，選取部分結合力較強結果利用Pymol軟件進行可視化。

2 結果

2.1 胎元飲有效成分及其相關作用靶點 在TCMSP數據庫中共得到符合篩選標準的有效成分191個，其中白芍14個，白術7個，陳皮77個，當歸5個，杜仲41個，甘草103個，人參25個，熟地黃11個(有的成分同時存在于不同的藥物中)。將8味中藥有效成分的作用靶點合并、刪除重復值后共得到靶點307個。

2.2 先兆流產相關靶點 在GeneCards、DrugBank數據庫中分別檢索出1849、3個先兆流產相關靶點，OMIM、PharmGKB、TTD數據庫中未檢索到相關靶點。把上述數據庫的相關靶點匯總、去重后共得到1849個疾病靶點。

2.3 “藥物-疾病”交集靶點 將篩選的307個胎元飲有效成分作用靶點與先兆流產疾病靶點取交集，再通過R 語言繪制韋恩圖，得到“藥物-疾病”交集靶點162個，見圖 1。

圖1 “藥物-疾病”交集靶點韋恩圖

2.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建及分析 運用 Cytoscape 3.7.2軟件構建胎元飲與先兆流產之間的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，見圖2。根據Cytoscape 3.7.2中“Network Analyzer”計算的Degree值，排名前3位的分別為山柰酚(kaempferol)、木黃酮(genistein)、熊果酸(ursolic acid)，為主要活性成分。見表1。

表1 胎元飲的主要活性成分

圖2 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖

2.5 PPI網絡構建及分析 將“藥物-疾病”交集靶點提交至STRING 11.0數據庫，得到PPI網絡，再將得到的網絡數據導入Cytoscape 3.7.2軟件進行網絡構建，獲得初始PPI網絡圖(見圖3A)。初始PPI網絡由162個節點和2875條邊組成。經CytoNCA插件進行拓撲學分析，得到由58個節點和1208條邊組成的精簡PPI網絡(見圖3B)。最終經 MCODE 1.6.1插件分析得到由48個節點和933條邊組成的核心靶點團(MCODE score為39.702)，在該靶點團中，MCODE score 排名前3的靶點分別為CC基序趨化因子2(C-C motif chemokine 2，CCL2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶 8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)(見圖3C)，其 MCODE score 分別為 28.29、28.24 和27.99。

圖3 PPI網絡圖

2.6 “藥物-疾病”交集靶點GO功能和KEGG通路富集分析 運用R語言對162個交集靶點進行 GO 功能富集分析，共獲得2854個條目，其中BP 2524個，MF 131個，CC 199個。根據P值排序，篩選出排名前10的條目繪制氣泡圖(見圖4)。根據氣泡圖結果，可以推測出胎元飲治療先兆流產的BP主要涉及對脂多糖反應(response to lipopolysaccharide)、對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)、肌肉細胞增殖(muscle cell proliferation)等；CC主要與膜筏(membrane raft)、膜微結構域(membrane microdomain)、膜區(membrane region)等相關；MF主要涉及血紅素結合(heme binding)、四吡咯綁定(tetrapyrrole binding)、絲氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)。

注：縱坐標為富集條目，橫坐標為該 GO 的基因數占輸入總基因的比率，氣泡越大代表該 GO 的基因越多；顏色代表P值的大小，P值越小，顏色越紅，則表示富集程度越高

KEGG 通路富集分析可獲得183條代謝通路，按P值由小到大排序篩選出排名前30的通路繪制條形圖(見圖5)，剔除不相關通路，預測胎元飲可能通過白細胞介素17(IL-17)信號通路(IL-17 signaling pathway)、p53通路(p53 signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路(PI3K/Akt signaling pathway)等治療先兆流產。通過查閱文獻，PI3K/Akt信號通路可能是胎元飲治療先兆流產的主要作用途徑，信號通路見圖6。

注：縱坐標為通路名稱，橫坐標為富集基因數；P值代表富集的顯著性，P值越小，顏色越紅，則富集程度越高

圖6 PI3K/Akt信號通路圖

2.7 分子對接結果 參考文獻[13-14]數據，結合能≤-5.0 kcal/mol認為可結合，≤-7.0 kcal/mol認為結合能力較強，即配體與受體具有較好的結合活性。若結合能>-5.0 kcal/mol認為結合能力較弱。本研究分子對接結果顯示，3個主要主要活性與3個核心靶點的結合能力整體較強，其中熊果酸與EGFR結合能為-9.4 kcal/mol，結合活性最高(見表2)。選擇各靶點對應成分結合能低且能形成氫鍵的對接組合進行繪圖。結果顯示，化學物配體均結合在靶蛋白的活性口袋內且匹配良好。各核心靶點-主要活性成分分子對接模擬圖及對接位點見圖7。

表2 分子對接結果 kcal/mol

注：A為山柰酚-CCL2對接圖，B為木黃酮-CCL2對接圖，C為熊果酸-CCL2對接圖；D為山柰酚-EGFR對接圖，E為木黃酮-EGFR對接圖，F為熊果酸-EGFR對接圖；G為山柰酚-MAPK8對接圖，H為木黃酮-MAPK8對接圖，I為熊果酸-MAPK8對接圖

3 討論

多項臨床研究已表明，胎元飲治療先兆流產有較好的療效。有研究顯示，胎元飲治療氣血虛弱型先兆流產2周后的有效率可達98%，并且發現胎元飲可能通過調節氣血虛弱型先兆流產患者外周血IL-2、干擾素γ(IFN-γ)、IL-10及轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達發揮治療作用[15]。趙偉等[16]研究顯示，加味胎元飲配合黃體酮治療早期先兆流產的療效及血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)水平均優于單用黃體酮治療(P<0.05)，由此可知加味胎元飲配合黃體酮治療先兆流產的效果優于單獨應用黃體酮。

本研究結果顯示，初始PPI網絡有162種靶點，存在2875種作用關系，充分體現了中藥多靶點的作用特點。MCODE 1.6.1插件分析得到3個核心靶點，分別為CCL2、EGFR、MAPK8。免疫學認為，妊娠屬于一種特殊的同種異體移植，妊娠結局的關鍵在于母體與胚胎之間的免疫平衡。趨化因子參與反復自然流產的發生發展，其高表達會使妊娠維持，減少流產，在維持胎兒正常發育中有重要作用。CCL2是典型的炎性趨化因子，與免疫系統密切聯系，參與血管生成、炎性反應過程，其異常表達可使胚胎植入、形成障礙從而誘發流產[17-18]。一項關于CCL2與早期流產相關性的臨床研究亦證明了早孕母胎界面絨毛和蛻膜組織中可見CCL2的表達，CCL2高表達與早期流產的發病機制有關[19]。胎盤是維持胎兒生長發育的重要器官，具有物質交換、防御、合成及免疫等功能。胎盤由羊膜、葉狀絨毛膜和底蛻膜構成，其中葉狀絨毛膜是胎盤的主要結構。生理狀態下，晚期囊胚著床之后，著床部位的滋養層細胞迅速分裂增殖。有研究報道，EGF及其受體在早期妊娠組織中表達下降，推測EGFR及其配體促進細胞增殖和分化的作用降低，從而使滋養細胞增殖、分化受到抑制，因此EGF調控HCG的生成及HCG維持黃體的作用受到抑制[20]。植枝福等[21]研究也證明了絨毛組織中EGFR的表達與絨毛血管生成狀況密切相關，EGFR低表達可導致絨毛血管形成障礙。輔助性T淋巴細胞(Th)在調節免疫反應中承擔著核心角色作用[22]。妊娠期間Th1細胞因子高表達，Th2細胞因子低表達，Th1/Th2細胞因子平衡偏向Th1可能與流產的發生相關[23]。MAPK8是Th細胞極化分化為Th1細胞必需的因子[24]，由此推測MAPK8與先兆流產存在著一定的聯系。分子對接驗證結果亦表明，山柰酚、木黃酮、熊果酸與核心靶點(CCL2、EGFR、MAPK8)的結合活性較強，因此胎元飲可能主要通過山柰酚、木黃酮、熊果酸等治療先兆流產。

GO功能富集分析顯示胎元飲治療先兆流產主要與脂多糖反應、對類固醇激素的反應、血紅素結合、絲氨酸水解酶活性等方面有關。KEGG通路富集分析顯示，壽胎丸治療先兆流產可能的信號通路為IL-17、p53、PI3K/Akt信號通路。細胞因子對于維持和協調人類孕期免疫細胞的正常活動至關重要。IL-17是一種促炎細胞因子，主要由Th17細胞產生。關于人類母胎界面，有學者認為蛻膜細胞通過分泌CCL2來吸引Th17細胞，并通過分泌IL-17抑制人類滋養層細胞的凋亡，并誘導它們增殖并侵入蛻膜[25]。有研究發現，血IL-17水平在健康妊娠中升高，但在自然流產中未表現升高，根據這一發現推測IL-17為維持妊娠必不可少的調節細胞因子[26]。有研究在人類自然流產絨毛中發現，在促凋亡合胞體滋養層中觀察到細胞質和頂膜上的層黏連蛋白受體表達增加，而這一過程最有可能是由p53介導的[27-28]。研究表明，p53信號通路功能異常及p53通路基因多態性的改變均可影響蛻膜化及妊娠結局[27]。相關文獻報道顯示，PI3K/Akt信號通路在細胞增殖和胚胎發育中扮演著重要角色[29]。若PI3K/Akt信號通路一旦受到抑制，可激活線粒體凋亡途徑，進而引起滋養細胞凋亡增加，最終導致分泌β-HCG和孕酮的功能降低，繼而可導致胎兒生長發育停止[30]。

綜上所述，本研究表明胎元飲治療先兆流產主要的活性成分可能為山柰酚、木黃酮、熊果酸等，這些活性成分通過作用于CCL2、EGFR、MAPK8等靶標以及調節IL-17、p53、PI3K/Akt等信號通路發揮治療作用，從而實現調節母體免疫狀態、促進滋養層細胞增殖等生物過程來維持妊娠，體現了胎元飲多通路、多靶點聯合作用的特點，為胎元飲治療先兆流產的臨床運用提供了科學依據，為后續挖掘其潛在作用機制提供了新角度。