2型糖尿病患者血清Ectodysplasin A與非酒精性脂肪性肝病相關性研究

錢方方，蔡珍生，顧恬，李昊翔，趙麗，楊玲，鄧霞，袁國躍

隨著生活水平的不斷提高，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病率逐年攀升，有研究表明，全球約25%的成年人受到NAFLD的困擾，總人數高達10億［1］。NAFLD常出現單純脂肪變性，進行性出現脂肪性肝炎，進一步發展為肝硬化和/或肝細胞癌，因此成為肝臟相關疾病發病率和死亡率增高的主要原因［2］。NAFLD常與血脂異常、胰島素抵抗、肥胖、高血壓、糖尿病等代謝紊亂疾病并發，被認為是代謝綜合征的主要特征［3］。有研究表明，2型糖尿病（T2DM）是NAFLD發生和發展的危險因素，其可能加重患者的血脂代謝紊亂，增加心血管疾病的發生率［4］。

近年來有研究發現，多種肝臟因子均參與了糖尿病、肥胖、代謝綜合征和NAFLD的發生、發展，并可能作為新的診斷性生物標志物來闡明代謝紊亂的發生機制［5］。Ectodysplasin A（EDA）基因位于染色體Xq12-13，最初被認為是腫瘤壞死因子相關細胞因子家族的成員，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，可在內蛋白酶呋喃切割后分泌到胞外結構域［6］。既往研究表明，EDA在牙齒、頭發和汗腺等皮膚衍生結構的發育和維持中起著重要作用，EDA基因突變可導致X連鎖少汗性外胚層發育不良［7］和選擇性非綜合征性牙齒發育不全［8］。隨著研究的深入，2017年，AWAZAWA等［9］發現了該基因表達的新功能——調節全身葡萄糖代謝，并導致骨骼肌胰島素敏感性受損，被認為是一種肝臟因子；該研究結果表明，高脂飲食小鼠和db/db小鼠的肝臟和血清EDA水平顯著升高；此外，還發現EDA的過度表達加劇了小鼠的糖耐量受損，敲除EDA能顯著改善小鼠骨骼肌胰島素敏感性。目前鮮有研究探討EDA與T2DM的關系，亦未見T2DM合并NAFLD人群中血清EDA水平的有關研究。本研究擬探討T2DM患者中血清EDA水平與各指標的相關性及T2DM患者血清EDA水平與NAFLD發生風險的相關性，為NAFLD早期篩查及治療提供新的理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年11月至2020年11月于江蘇大學附屬醫院內分泌科就診的T2DM患者130例為研究對象，其中男74例（56.92%）、女56例（43.08%），平均年齡（55.6±12.4）歲。納入標準：（1）符合T2DM的診斷標準，參照美國糖尿病協會（ADA）頒布的糖尿病診斷標準［10］；（2）年齡＞18周歲。排除標準：（1）特殊類型糖尿病、1型糖尿病、糖尿病急性并發癥者；（2）各種病毒性肝炎、自身免疫性疾病及遺傳性肝炎、藥物性肝病者；（3）過量飲酒者；（4）妊娠和哺乳者；（5）口服調血脂藥物進行治療者；（6）有冠心病、腦梗死、急性感染及惡性腫瘤史者。本研究經江蘇大學附屬醫院生物醫學研究倫理委員會批準（SWYXLL20181217-1），研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 一般資料 收集患者的一般資料，包括性別、年齡、T2DM病程、高血壓病史、吸煙史（既往或者目前吸煙且未戒煙者或者戒煙不足半年）、飲酒史（既往或者目前飲酒且未戒酒者或者戒酒不足半年）、身高、體質量、腰圍（WC）、臀圍（HC）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP），計算體質指數〔BMI=體質量（kg）/身高（m）2〕和腰臀比（WHR=WC/HC）。

1.3 實驗室檢查指標 患者隔夜禁食8～10 h后，次日行75 g口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）及胰島素釋放試驗，采集靜脈血后使用葡萄糖氧化酶法檢測血糖〔空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2 hPG）〕水平，通過化學發光法測定胰島素〔空腹胰島素（FIns）、餐后2 h胰島素（2 hIns）〕以及C肽〔空腹C肽（FCP）、餐后2 hC肽（2 hCP）〕水平。計算穩態模型評估胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=FPG×FIns/22.5和胰島β細胞功能指數（HOMA-β）=FIns×20/（FPG-3.5）。使用高效液相層析法檢測糖化血紅蛋白（HbA1c）。采用酶法檢測三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）。使用全自動生化儀檢測血尿酸（SUA）、血肌酐（Scr）與尿素氮（BUN）水平。

1.4 EDA水平測定 使用市售人酶聯免疫吸附測定法（ELISA，武漢伊艾博生物公司，Catalog No.E1976H）測定血清EDA水平，試劑盒的靈敏度＜20 ng/L，批內變異系數（CV）≤7.8%，批間CV≤8.9%，按照試劑盒說明進行操作。用酶標儀（ThermoFisher，Multiskan GO）檢測450 nm處的吸光度值，并繪制標準曲線。ELISA檢測范圍為78～5 000 ng/L。

1.5 NAFLD超聲診斷 采用全身彩色多普勒診斷儀LOGIQ-9由專業超聲醫生進行腹部超聲檢查。NAFLD的診斷基于中華醫學會肝臟病學分會制訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年1月修訂）》［11］。根據超聲檢查結果將患者分為兩組：NAFLD組（80例）和非NAFLD組（50例）。

1.6 統計學方法 使用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以相對數表示，兩組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關或Spearman秩相關分析評估血清EDA與各指標的相關性；采用多元線性回歸分析探討T2DM患者血清EDA水平的影響因素；采用多因素Logistic回歸分析探討T2DM患者血清EDA水平對NAFLD發生風險的影響。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者基線資料比較 兩組患者性別、高血壓病史、吸煙史、飲酒史、WHR、SBP、DBP、FPG、2 hPG、HOMA-β、HbA1c、TC、HDL-C、LDL-C、Scr比 較，差異無統計學意義（P＞0.05）；NAFLD組患者年齡、T2DM病程低于非NAFLD組，而BMI、FIns、2 hIns、FCP、2 hCP、HOMA-IR、TG、ALT、AST、SUA、BUN、EDA水平明顯高于非NAFLD組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data between T2DM patients with and without ultrasound-detected NAFLD

2.2 T2DM患者血清EDA與各指標的相關性分析相關性分析結果顯示，T2DM患者血清EDA與年齡、FIns、2 hIns、HOMA-IR、AST呈正相關（P＜0.05），見表2。

表2 T2DM患者血清EDA與各指標的相關性分析Table 2 Correlation analysis of serum ectodysplasin A with clinical and biochemical indices in T2DM patients

2.3 T2DM患者血清EDA水平影響因素的多元線性回歸分析 以EDA為因變量，以年齡、T2DM病程、BMI、WHR、SBP、DBP、FPG、2 hPG、FIns、FCP、2 hCP、HbA1c、HOMA-IR、HOMA-β、TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、SUA、Scr、BUN 為 自變量進行多元線性回歸分析（因變量、自變量賦值均為實測值），結果顯示，年齡、WHR、2 hIns、AST是T2DM患者EDA水平的影響因素（P＜0.05），見表3。

表3 T2DM患者血清EDA水平影響因素的多元線性回歸分析Table 3 Multiple linear regression analysis of factors associated with serum ectodysplasin A in T2DM

2.4 T2DM患者血清EDA水平對NAFLD發生風險影響的多因素Logistic回歸分析 以是否發生NAFLD為因變量，以臨床常見的混雜因素EDA、高血壓病史、吸煙史、飲酒史、性別、年齡、病程、BMI、WHR為自變量進行多因素Logistic回歸分析，各變量賦值情況見表4。結果顯示，在未校正模型、模型1（校正年齡、病程）、模型2（校正年齡、病程、性別、BMI、WHR）、模型3（校正年齡、病程、性別、BMI、WHR、高血壓病史、吸煙史、飲酒史）中，血清EDA均是T2DM患者發生NAFLD的影響因素（P＜0.05），見表5。

表4 T2DM患者發生NAFLD影響因素的多因素Logistic回歸分析賦值表Table 4 Assignment for influencing factors of NAFLD in T2DM analyzed using multivariate Logistic regression

表5 T2DM患者血清EDA水平對NAFLD發生風險影響的多因素Logistic回歸分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis of factors affecting NAFLD in T2DM patients

3 討論

肝臟可分泌多種蛋白質因子形成調節網絡，并通過組織間通信影響肝臟和其他器官的能量代謝［7］，從而影響代謝相關疾病的發生和發展，如肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、脂肪肝等［12-15］。本研究初步探討了T2DM患者肝臟因子EDA與NAFLD的相關性。研究結果顯示，T2DM合并NAFLD組血清EDA水平明顯高于非NAFLD組，年齡、WHR、2 hIns、AST是EDA的獨立相關因素。更重要的是，NAFLD的發生風險隨血清EDA水平的增加而增加，提示EDA可能是T2DM合并NAFLD發生、發展的重要危險因素。

高脂血癥、肥胖、胰島素抵抗是導致T2DM、NAFLD的重要危險因素［16-17］。其中，脂質代謝紊亂起到至關重要的意義，其主要特征是TG升高，肝臟脂質堆積加劇肝脂肪變性［18］。此外，胰島素抵抗以及肝臟TG釋放脂肪酸（FA）增加導致肝臟FA水平升高，而脂質沉積產生的脂毒性，進一步加劇肝細胞的損傷和炎癥進展，最終導致肝纖維化［19］。本研究結果顯示，與非NAFLD組相比，NAFLD組BMI、FIns、2 hIns、FCP、2 hCP、HOMA-IR、TG、ALT、AST、SUA 和BUN水平均顯著升高，這與既往研究結果一致［20］。這些結果共同表明T2DM合并NAFLD患者血脂水平更高，體型更為肥胖，胰島素抵抗更為明顯。

EDA作為一個新發現的肝臟因子，近年來被認為與肥胖、胰島素抵抗、T2DM和NAFLD密切相關［21］。本研究首次發現，與單純T2DM組（非NAFLD組）相比，T2DM合并NAFLD組患者血清EDA水平顯著升高，且與年齡、FIns、2 hIns、HOMA-IR、HOMA-β、AST、Scr呈正相關。在校正臨床常見的危險因素后，多因素Logistic回歸分析顯示EDA仍是T2DM患者發生NAFLD的獨立危險因素。本研究結果與既往研究并不完全一致，YANG等［22］的研究結果顯示，與正常受試者相比，NAFLD患者EDA水平顯著升高，且與HOMA-IR、BMI、WHR、FPG和HbA1c呈正相關。此外，BAYLISS等［23］也同樣發現與正常受試者相比，NAFLD患者EDA水平顯著升高，然而進一步的相關性分析卻發現血漿EDA與HOMA-IR、FPG和HbA1c無明顯相關性。研究結果不一致的原因可能是多方面的，首先，研究人群不同，本研究的研究對象是T2DM合并NAFLD人群，YANG等［22］針對的是單純NAFLD人群，而BAYLISS等［23］研究的則是NAFLD合并T2DM患者；其次，樣本量的差異以及藥物和疾病不同階段的病理特征等均可能對結果產生一定影響。而且，本研究和YANG等［22］采用的腹部超聲方法診斷NAFLD，而BAYLISS等［23］則采用的是肝活檢和組織學評估，不同的診斷標準也會對結果產生影響。此外，既往研究還發現，肝臟EDA的表達與肝臟脂肪含量和內臟脂肪面積呈正相關，并與組織學確定的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）炎癥和脂肪變性評分呈正相關［9］。越來越多的基礎研究證據表明，EDA在脂質代謝中起著重要作用。在動物研究中，缺乏EDA的小鼠顯著減少了高脂飲食（HFD）引起的肝脂滴增加，降低了HFD模型小鼠的肝TG含量，并降低了ALT和AST水平。此外，在HepG2細胞中，游離脂肪酸（FFA）干預顯著增加了細胞和細胞培養上清液中EDA蛋白的表達。進一步的機制研究表明，EDA基因敲除可以增加肉堿棕櫚酰轉移酶1A（CPT1A）的表達，這是脂肪酸氧化的關鍵酶，并降低固醇調節元件結合蛋白1c（SREBP-1c）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合酶（FAS）的表達［22］。以上結果提示，EDA作為一種新型的肝臟因子，可能參與NAFLD的發生與發展，并可作為NAFLD風險評估的良好指標。

此外，本研究還發現，年齡越大，2 hIns和AST越高，則血清EDA水平越高，年齡是不可控制的危險因素，而2 hIns和AST是可控制的因素，因此當機體胰島素抵抗和肝功能改善可能降低血清EDA水平從而進一步緩解脂代謝紊亂。本研究結果還顯示，T2DM合并NAFLD患者的年齡與病程明顯低于非NAFLD組。考慮到本研究中研究對象的特點，老年患者的脂肪儲存能力較差，肝纖維化比例增加，T2DM干預和治療持續時間較長，死亡率較高，均可能在一定程度上影響研究結果［24］。

綜上所述，T2DM合并NAFLD患者血清EDA水平顯著增高，且與胰島素抵抗密切相關，揭示EDA是T2DM患者發生NAFLD的重要危險因素，可能參與NAFLD的發生與發展，但其作用機制仍未闡明，需進一步深入研究。本研究也存在一定的局限性：（1）本研究是一項橫斷面研究，樣本量小，因果關系無法明確，可能影響結果的準確性；（2）由于缺乏正常受試者作為對照，可能導致研究結果缺乏可信度；（3）本研究通過超聲診斷NAFLD，而非采用肝臟穿刺病理活檢，可能對結果產生一定影響。

作者貢獻：袁國躍提出研究構思；鄧霞、袁國躍進行可行性分析、研究指導；蔡珍生、顧恬、李昊翔參與數據采集、整理；錢方方負責數據的收集、統計分析及撰寫論文，對論文負責；趙麗、楊玲進行寫作指導及論文修訂。

本文無利益沖突。