新風膠囊調控巨噬細胞M1/M2型極化對DBA/1小鼠膠原誘導型關節炎的影響

陶艷紅 ，劉健，徐昌萍，陳君潔，周娜，王澤，曹云祥，黃傳兵

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，其特征是由浸潤性的滑膜炎癥導致的關節損傷，進而產生軟骨和骨質侵蝕，最終引起關節畸形，對病人的日常活動有著嚴重不良影響［1］。雖然RA的確切發病機制尚不清楚，前期多項研究發現巨噬細胞是引起RA 的關鍵性因素之一。巨噬細胞是機體的免疫細胞，被發現可趨化至關節滑膜處，參與機體炎癥反應［2-5］。現代研究表明，巨噬細胞能夠發揮免疫應答作用，進而維持機體內環境的穩態，當這種動態平衡被打破時，在特定環境下，巨噬細胞可極化為M1和M2型，M1型分泌大量的炎性因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-1等，同時TNF-α 還可活化免疫細胞中的核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路，放大炎癥效應，從而引起并加劇組織細胞損傷，M2型釋放抑炎因子，可降低人體的炎癥反應，在組織修復中發揮作用［6-7］。通過建立RA動物模型，研究人員發現促進滑膜組織的巨噬細胞凋亡或抑制M1型極化，可達到緩解RA的目的［8-9］。由此可見，調控巨噬細胞M1/M2型極化可有效干預滑膜組織中炎癥的發展。

目前，西醫在臨床治療上采用非甾體抗炎藥、抗風濕藥物、糖皮質激素和生物制劑等雖然能夠有效地改善RA的長期治療預后，但同時也伴隨著對人體肝、腎臟各項機能的損害、胃腸道反應和白細胞數量的減少等多種情況導致的不良反應［10］。因此，尋找一條新的輔助治療思路極為迫切，近年來，隨著中醫中藥的發展與崛起，傳統中醫藥具有成本低、毒副作用小、整體調理等優勢，其在RA中的推廣與使用引起了人們越來越廣泛的關注。新風膠囊（Xinfengcapsule，XFC）是安徽中醫藥大學第一附屬醫院生產的中藥復方制劑，由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣四種中藥材組成，具有益氣健脾、通絡止痛之功。課題組前期研究證實，XFC被發現可以減輕實驗動物RA癥狀，并具有抗炎功能，但其緩解RA潛在的調控機制尚需深入研究［11-12］。本研究自2020年6月至2021年5月以膠原誘導型關節炎（collageninduced arthritis，CIA）小鼠為模型，巨噬細胞極化為主線，通過動物體內外實驗來探討XFC調控巨噬細胞極化對改善RA的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性DBA/1小鼠購自北京華阜康，許可證號SCXK（京）2019-0008。飼養于安徽中醫藥大學動物實驗中心，實驗光照時間為7點至19點，研究人員將飼養環境設置為室溫20～26 ℃、相對濕度40%～70%，在該條件下對小鼠實施適應性喂養。最后取18只7～8周齡，體質量18～22 g的雄性小鼠開展實驗。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 實驗藥品與試劑 牛源性Ⅱ型膠原購于美國Chondrex；HE染色試劑盒、蛋白質印跡（Western blotting）試劑盒購于碧云天，二甲苯購于上海化學試劑有限公司；全蛋白提取試劑盒購于上海源葉生物科技有限公司；二辛可寧酸（BCA）蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；增強化學發光法（ECL）發光液購自Millipore；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）購自Bio-Rad。

1.2.2 主要儀器 冰凍切片機購自日本 Olympus公司；電泳儀購自福祿克國際；凝膠成像儀購自SIM公司；4 ℃冰箱購于北京福意電器有限公司；轉膜儀購自Bio-Rad。

1.3 方法

1.3.1 CIA模型的建立、分組和給藥 小鼠適應性飼養1周后，按體質量隨機分為三組，分別為NC組、M組和XFC組，每組6只。選用 M 組和XFC組開始造模。將2 g/L 牛源性Ⅱ型膠原（bovine collagen Ⅱ，BⅡ）在等量Freund’s complete adjuvant中進行乳化，在小鼠尾根部皮下注射100 μL乳化BⅡ。第21天將BⅡ在等量Freund不完全佐劑中進行乳化并以同樣的方式加強免疫。第二次免疫當天，XFC組每天灌胃一定濃度的實驗藥物治療。鑒于課題組前期研究基礎，NC組及M組予生理鹽水灌胃，1 mL/100 g，每天1次。XFC組：新風膠囊混懸液1.5 mL/100 g灌胃，每天1次［13］。持續給藥至二個時間節點（42 d）處死小鼠取材，第42天處死小鼠進行關節滑膜組織檢測。

1.3.2 記錄關節炎指數（arthritis index，AI）評分首次免疫后，研究人員每3 d記錄各組小鼠發生關節炎的爪數，并對每只關節炎爪的關節嚴重程度進行評分。計算平均值并連續記錄至第42天。AI評分最高為16分，按照AI評分標準將四肢紅腫程度評為1～4分。0分：無紅腫；1分：輕微發紅；2分：中度發紅；3分：全足明顯紅腫；4分：全足紅腫，伴關節變形和運動障礙。AI評分≥ 1分即為造模成功［14］

1.3.3 HE染色法觀察滑膜組織病理學變化 取小鼠右后肢，4%多聚甲醛固定，乙醇分步脫水，二甲苯透明后石蠟浸漬，包埋，制成蠟塊后切成4 μm薄片；將蠟塊組織依次浸入二甲苯（Ⅰ）及二甲苯（Ⅱ）各10 min，隨后將乙醇分步脫水，用蒸餾水洗滌2 min；蘇木素染色5 min，清水沖洗1 min，鹽酸乙醇分化 20 s，酸水、氨水反藍 20 s，伊紅染色 5 min，再次使用乙醇分步脫水，經二甲苯使切片透明，將透明的切片滴上樹膠，然后用蓋玻片密封，制成中性樹膠封片，顯微鏡下觀察小鼠關節的形態和結構。

1.3.4 Western blotting檢測蛋白表達水平 用預冷的PBS 緩沖液洗滌關節滑膜組織，加入50 μL裂解液，并與 100 mol/L PMSF 以100∶1混合制備，處理25 min至完全裂解，然后將蛋白吸于EP 管，在4 ℃，12 000 r/min下離心 5 min，吸取上清置于-80 ℃環境中，分裝保存。用BCA試劑盒測量OD值，計算蛋白量，配制SDS-PAGE 凝膠，加入樣品，使樣品在100 V電泳條件下分離，恒定電流轉移至預先準備的PVDF膜上1 h。使用5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋后的CD68抗體、INOS抗體、GAPDH抗體，搖床4 ℃孵育過夜。將一抗回收，用Western液洗滌5～10 min，共3次，二抗同樣孵育1 h，用Western液洗滌，ECL試劑檢測蛋白。

1.4 統計學方法使用 SPSS 21.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用 LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIA造模成功及關節炎嚴重程度評分M組、XFC組小鼠造模后足爪均充血紅腫，關節開始出現畸形，小鼠活動受限，NC組四肢無紅腫、畸形，AI評分為0。第二次免疫開始，每3 d記錄發生關節炎的爪數、右后爪關節炎嚴重程度評分和四肢關節炎評分均值。實驗結果表明：

①首次免疫后21 d～42 d，NC組小鼠四肢發生關節炎的次數為0，M組和XFC組發病的關節數量均高于NC組，隨著時間延長，兩組的關節炎爪數也相應升高，M組于致炎30 d發病至最高峰，后保持不變；與M組比較，XFC組上升速度明顯減緩，發病爪數明顯減少（表1）。

表1 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關節炎（CIA）小鼠發生關節炎爪數的影響/± s

表1 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關節炎（CIA）小鼠發生關節炎爪數的影響/± s

注：①與NC組比較，P＜0.05。②與 M組比較，P＜0.05。

組別NC M XFC 1.5 mL/100 g F值P值鼠數6 6 6 21 d 0 0 0 24 d 0 0.83 ± 0.75①0.50 ± 0.55①②3.65 0.051 27 d 0 2.17 ± 0.41①1.00 ± 0.63①②37.35＜0.001 30 d 0 3.83 ± 0.41①1.50 ± 0.55①②143.93＜0.001 33 d 0 3.83 ± 0.41①1.67 ± 0.52①②153.46＜0.001 36 d 0 3.83 ± 0.41①1.83 ± 0.41①②198.50＜0.001 39 d 0 3.83 ± 0.41①2.00 ± 0.63①②116.77＜0.001 42 d 0 3.83 ± 0.41①2.17 ± 0.41①②199.50＜0.001

②首次免疫后21～42 d，NC組右后爪關節炎嚴重程度評分為0，M組評分隨時間延長明顯上升后緩慢下降，XFC組評分緩慢上升后緩慢下降，且上升幅度始終低于M組（表2）。

表2 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關節炎（CIA）小鼠右后爪關節炎嚴重程度評分的影響/（分，± s）

表2 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關節炎（CIA）小鼠右后爪關節炎嚴重程度評分的影響/（分，± s）

注：①與NC組比較，P＜0.05。②與 M組比較，P＜0.05。

組別NC M XFC 1.5 mL/100 g F值P值鼠數6 6 6 21 d 0 0 0 24 d 0 0.50 ± 0.84①0.33 ± 0.52①②1.21 0.327 27 d 0 1.17 ± 0.75①0.50 ± 0.84①②4.87 0.023 30 d 0 2.83 ± 0.75①1.00 ± 1.10①②21.04＜0.001 33 d 0 2.67 ± 0.52①1.33 ± 1.03①②24.000＜0.001 36 d 0 2.67 ± 0.52①1.33 ± 0.82①②34.29＜0.001 39 d 0 2.67 ± 0.52①1.17 ± 0.75①②38.60＜0.001 42 d 0 2.50 ± 0.55①1.17 ± 0.75①②32.50＜0.001

③首次免疫后21～42 d，NC組四肢評分均值為0，隨著造模時間延長，M組四肢評分均值緩慢上升，XFC組先緩慢上升，于致炎第39天至最高峰，后出現逐漸下降趨勢，且XFC組評分均值始終低于M組（表3）。

表3 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關節炎（CIA）小鼠四肢關節炎評分均值的影響/（分，± s）

表3 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關節炎（CIA）小鼠四肢關節炎評分均值的影響/（分，± s）

注：①與NC組比較，P＜0.05。②與 M組比較，P＜0.05。

組別NC M XFC 1.5 mL/100 g F值P值鼠數6 6 6 21 d 0 0 0 24 d 0 0.25 ± 0.27①0.13 ± 0.14①②3.00 0.080 27 d 0 0.92 ± 0.47①0.33 ± 0.20①②15.00＜0.001 30 d 0 2.17 ± 0.38①0.75 ± 0.27①②100.58＜0.001 33 d 0 2.17 ± 0.34①0.75 ± 0.25①②130.75＜0.001 36 d 0 2.25 ± 0.27①0.79 ± 0.19①②212.36＜0.001 39 d 0 2.21 ± 0.25①0.83 ± 0.26①②176.15＜0.001 42 d 0 2.29 ± 0.33①0.79 ± 0.19①②167.21＜0.001

2.2 CIA 小鼠踝關節組織HE染色結果NC組關節組織形態結構正常，滑膜腔內未見明顯炎性細胞浸潤，M組滑膜腔內可見炎性細胞浸潤及血管翳形成，軟骨表面被侵蝕，增生滑膜侵入皮下。與M組相比，XFC組滑膜腔內血管翳減少，關節組織結構基本正常（圖1）。

2.3 XFC降低CIA小鼠滑膜組織CD68、iNOS的蛋白表達水平蛋白質印跡法結果表明：與NC組比較，M組與XFC組小鼠滑膜組織中CD68、iNOS蛋白表達均增加；與M組相比，XFC組小鼠滑膜組織中CD68和iNOS蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 XFC對CIA小鼠滑膜組織CD68、iNOS的蛋白表達的影響

3 討論

RA屬于中醫“痹證”范疇，因其病程長而難以治愈，后人稱之為“尪痹”，是風濕免疫科的常見病癥之一［15］。臨床上RA多表現為關節腫痛，嚴重者可導致關節變形。RA的病理基礎為滑膜炎癥。本研究結果發現，XFC具有降低CIA小鼠模型AI評分、血管翳形成和滑膜炎癥細胞浸潤數量，降低關節滑膜組織中CD68、iNOS的蛋白表達水平的作用。表明XFC具有改善CIA小鼠體內炎癥誘導的關節滑膜損傷的功能。

作為公認研究人類RA的經典動物模型，CIA 小鼠易感且成本較低，能夠模擬RA的治療作用，目前是人類較為理想的動物模型［16］。由于該動物模型造模成熟和發病穩定，而被廣泛應用于RA治療的多個研究和探索的領域，因此，選用CIA模型突出了XFC治療作用的靶點。中藥復方XFC遵循中醫整體調節的原則，方中黃芪益氣健脾；薏苡仁可達健脾利濕、舒筋除痹之功；雷公藤消腫止痛；蜈蚣祛風通絡止痛，根據現代藥理學研究成果，方中選用的中草藥具有抗風濕、調節免疫、抗炎等藥理作用［17］。課題組初步發現，使用XFC治療AA大鼠后，血清中IL-10顯著升高，IL-17 水平顯著降低，前期已發現IL-17 是參與自身免疫性疾病發生、發展的重要炎癥介質，由此推測XFC具有抗炎作用［18-19］。實驗結果顯示與M組相比，治療后小鼠AI評分、滑膜中血管翳形成數量和炎性細胞浸潤明顯減少，提示XFC能夠顯著改善CIA小鼠的關節腫脹情況，抑制血管翳的生成，抑制炎癥發展，這與之前的研究結果保持一致。

現代研究認為，巨噬細胞參與機體固有免疫系統，具有吞噬、殺滅病原微生物、炎癥防御等功能，在人體非特異性免疫中發揮了重要作用。在人體被外界因素刺激時，巨噬細胞會表現為活化狀態，從而清除異物，來保護人體不被傷害。然而，當巨噬細胞清除異物時，也隨之會釋放TNF-α、IL-1等炎性因子，導致人體產生炎癥反應，進而對機體某些組織造成損傷。通常巨噬細胞不會大量增多，當其受到某種信號，如巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF） 、表皮生長因子（EGF）的誘導時，會在機體內大量增殖。GM-CS是一種在造血細胞產生及活性表達的過程中發揮調節作用的細胞因子。GMCSF 在正常生理條件下的表達水平較低。當人體發生感染或炎癥時，GM-CSF可短時間內急劇增加。在自身免疫炎癥小鼠模型中，GM-CSF 阻斷劑減少了中性粒細胞和單核細胞的聚集，從而降低疾病的嚴重性［20］。此外，GM-CSF還能將巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞，產生并分泌TNF-α、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等致炎因子［21］。CD68是巨噬細胞的通用標志物，可以同時識別M1和M2兩種表型［22］。iNOS的表達和活性可用于M1型和M2型巨噬細胞的鑒別，在巨噬細胞中，M1型則以高度表達 MCP-1和iNOS 等促炎細胞因子為標志［23-24］IA動物模型中，XFC組CD68、iNOS的蛋白表達水平顯著低于模型組，由此推測XFC可能通過下調滑膜組織中中M1型巨噬細胞的表達抑制促炎細胞的釋放，以減輕關節炎癥。

綜上所述，新風膠囊可緩解因滑膜炎癥導致的關節紅腫疼痛，并可能通過下調滑膜組織中M1型巨噬細胞表達，抑制炎性因子的產生和分泌，從而對CIA小鼠模型產生保護作用。