卵母細胞非整倍性改變的研究進展

楊佳怡，李越 ，班利榮，張娜，李靜，張巖

染色體非整倍性改變最早是由Gunnar T?ckholm在1922年提出的，是指體細胞中染色體數目增加或減少一條到數條，結果形成非整倍體［1］。在正常有性生殖過程中，每個胚胎分別從父親和母親那里繼承 22 條常染色體和1條性染色體，形成具有22對常染色體和1對性染色體的正常胎兒，而非整倍體是指繼承了太多或太少的任何染色體，這是臨床上最常見的染色體畸變類型。如果胎兒僅從父親或者母親一方繼承了一個拷貝的常染色體，我們稱之為常染色體單體，這樣的胎兒會出現嚴重的異常并在臨床確認懷孕前死亡；如果胎兒多繼承一個常染色體，我們稱之為常染色體三體，這個額外拷貝也與嚴重的發育異常有關，約占所有流產的三分之一；如果胎兒少繼承或者多繼承了性染色體，會造成性發育異常，包括性腺或者第二性征異常，我們稱之為性染色體非整倍體。相對于少一條常染色體的致命打擊，多一條常染色體和性染色體的變化對機體造成的損傷略柔和一些，因此我們在臨床上能夠看到有常染色體三體和性染色體非整倍體的胎兒活著出生。21號染色體三體就是唐氏綜合征的病因，也是迄今為止影響活產胎兒的最常見的非整倍性改變。

經過數十年的研究，科學家們發現了導致衰老卵母細胞非整倍體的許多可能原因，例如不令人滿意的交叉形成、黏連蛋白丟失、紡錘體組裝缺陷、紡錘體組裝檢查點故障、微管-動粒附著失敗、動粒定向錯誤、DNA 損傷等方面［2-3］。然而，這些非整倍體化因素是否存在內在關系，以及如何防止老年卵母細胞發生非整倍體化等問題仍需解答。在這篇綜述中，我們總結了卵子發生的特點，卵母細胞非整倍體的研究進展等，并提出了卵母細胞非整倍體的綜合觀點。

1 卵母細胞發育概述

哺乳動物的卵子發生始于卵母細胞從胎兒卵巢中的原始生殖細胞的分化。雌性小鼠的生殖細胞在胚胎期12.5 d和13.5 d之間通過雌性途徑分化為卵母細胞，此過程通常還伴有從有絲分裂到減數分裂的轉變［4］。啟動減數分裂的卵母細胞包含每條染色體的兩個同源拷貝，每個染色體在減數分裂 S期復制形成兩個姐妹染色單體，并通過姐妹染色單體凝聚在一起。在減數分裂 S 期后，卵母細胞進入第一次減數分裂的細線期，并通過產生 DNA 雙鏈斷裂 （DNA double-strand break，DSB） 來啟動減數分裂重組，這些 DNA 雙鏈斷裂招募修復蛋白形成重組灶［5］。在偶線期和粗線期，重組灶成熟，并招募一系列促進重組中間體分解為交叉交換或非交叉交換的因素［5］。非交叉交換僅獲得短片段的同源序列，用作修復 DNA 損傷的模板，而交叉交換在交叉位點遠端的同源染色單體之間交換染色單體臂。這些交叉可能會起到兩個作用：（1）增加種群的遺傳多樣性；（2）若聯會復合體在雙線期中分解，能夠提供將同源染色體保持在一起的物理連接［6］。在出生前后，發育中的卵母細胞停滯在交叉口處，將同源染色體保持在一起作為一個二價體單元。在這種長時間的停滯期間（在人類中持續數十年），交叉體由姐妹染色單體之間的內聚力維持，尤其是交叉口遠端染色體臂上的內聚力［6］。

當女孩性成熟后，在月經周期中，激素的刺激會誘導成組的優勢卵母細胞生長、成熟，最終恢復減數分裂并進展到中期Ⅰ。同源染色體之間的這些物理連接，結合姐妹染色單體的著絲粒的單向度，使得來自每個同源染色體的著絲粒連接到相反的紡錘體極時產生張力［6］。當卵母細胞由中期Ⅰ到后期Ⅰ轉變時，染色體臂上的姐妹染色單體凝聚力被釋放，使交叉溶解，同源染色體分離到相反的紡錘體極，而姊妹染色單體在著絲粒上的凝聚力在這一點被保留，并將兩個姊妹染色單體連接在一起［7］。當卵母細胞進入MⅡ時，每一對姐妹染色單體在中期Ⅱ紡錘體上與姐妹著絲粒雙定向到相反的紡錘體極。然后，卵母細胞在中期Ⅱ停止活動，通常在受精后完成減數分裂，移除著絲粒凝聚力，使姐妹染色單體分離并分開到相反的紡錘體極［7］。卵母細胞的兩次減數分裂都是不對稱的，并將一組染色體擠出到小的極體中，在著床前發育過程中這些極體會退化，而在較大的、發育能力較強的卵母細胞中保留一組單倍染色體。因此，在卵母細胞發育過程中，姊妹染色單體之間產生并維持的內聚性和同源體之間的交叉是防止非整倍體傳遞給下一代的關鍵。

2 母親年齡與染色體非整倍性改變

隨著年齡的增長，女性的懷孕能力逐漸喪失，不孕癥大多數發生在35～45歲，減數分裂中染色體分離錯誤在這個年齡窗也急劇增加［8］。在達到臨床識別的自然受孕中，35%的人類妊娠是非整倍體；在著床前胚胎中觀察到的比率要高得多，部分原因是非整倍體胚胎發育潛力差，在著床周階段和懷孕過程中被選擇［9］。35歲婦女的卵母細胞中有20%的非整倍體，而43歲以上婦女的卵母細胞中有近60%的非整倍體，母親年齡是影響非整倍體的主要因素，并產生了特征性的J曲線，自然妊娠中三體性發病率在最年輕的母親年齡略有增加，在更年期前的十年呈指數增長［9］。非整倍體的J型曲線是三種不同錯誤類型的組合：（1）減數分裂Ⅰ不分離，即整條染色體的增加或減少；（2）姊妹染色單體的提前分離，在減數分裂Ⅰ時同源染色體中的一個姐妹染色單體提前分離；（3）反向分離，兩條同源染色體同時在減數分裂Ⅰ將姐妹染色單體分離［8］。唐氏綜合征病人的基因分型表明，大約四分之三的母源性病例是由同源染色體的錯誤分離引起的，四分之一是由姐妹染色單體的錯誤分離引起的［8］。這與大量細胞學數據一致，表明高齡女性人類卵母細胞中最普遍的染色體錯誤分離事件涉及MⅠ 期間姐妹染色單體的過早分離［8］。

對接受輔助生殖手術的女性卵子的早期研究表明，姐妹著絲粒的過早分離是人類非整倍體發育的主要機制［10］。最近提出的兩次打擊模型表明，MⅠ 期間的分離錯誤是由在胎兒階段產生易感交叉配置的第一次打擊和包括年齡相關的染色體凝聚力在減數分裂前期阻滯期降低的第二次打擊的組合引起的［11］。二價體的完整性對精確的染色體分離至關重要，然而，最近對人類卵母細胞的研究表明，在老年婦女卵母細胞中二價體的結構趨于瓦解［12］。在小鼠和人類中，二價體隨著年齡增長會出現兩種主要的結構缺陷。首先，姐妹著絲粒分離的距離很大，這與姐妹著絲粒與減數分裂紡錘體不協調且常常錯誤地連接有關；其次，來自老年卵母細胞的二價體更容易分裂成單獨的染色體，稱為單價體，一對單價體可以以不協調的方式分離，也可能導致非整倍性［2］。單價體的著絲粒強烈偏向于雙極微管附著，由于同源染色體的著絲粒之間的張力損失，單極微管與姐妹染色單體的著絲粒的連接無法穩定，而雙極連接可以通過姐妹染色染色單體著絲粒之間的張力穩定；另外，與年齡相關的姐妹染色染色單體著絲粒的內聚力的喪失可能會破壞 MⅠ特定的姐妹染色染色單體著絲粒幾何結構［12］。綜合這些發現，我們認為在人類卵母細胞 MⅠ 期間，二價體過早分離為單價體是導致年齡相關分離錯誤的主要原因。

3 減數分裂過程中的性別特異性差異

如上所述，對臨床認可的妊娠的研究表明，大多數人類非整倍體是母系來源的這就引出了一個問題：為什么女性減數分裂如此容易出錯？Hunt、Hassold［13］認為男性的粗線期檢查點機制較女性更為嚴格，減數分裂期間性染色體活性的差異可能是兩性差異的基礎。在小鼠中，減數分裂前期的聯會缺陷在雄性中幾乎總是導致精母細胞死亡，無論是在粗線期還是在第一次減數分裂的中期，而雌性在面臨許多導致雄性完全減數分裂停滯和不育的突變時卻仍保持生育能力，盡管它們的生殖壽命可能會大大縮短［13］。此外，如前面所述，精子發生和卵子發生之間最明顯的差異發生在粗線期之后：雄性配子在減數分裂的其余部分快速進行，但卵母細胞在前期Ⅰ停滯數周至數月（在小鼠）或數十年（在人類）。研究證實，在胎兒發育過程中加載到染色體上的黏連蛋白對于調節完全成熟的卵母細胞的內聚力是必要的和足夠的，凝聚力的喪失是產婦年齡效應另一個原因［14-15］。具體來說就是50 歲女性卵母細胞中的染色體分離可能依賴于 50 歲的黏附蛋白復合物，所以隨著年齡的增加減數分裂時染色體的錯誤概率分配隨著增加。另外，最近的研究還發現，精母細胞和卵母細胞對中期染色體行為紊亂的反應能力也是不同的［16］。在雄性小鼠中，這種反應是強烈的，減數分裂中期Ⅰ二價體提前分裂為單價體是不能通過紡錘體組裝檢查點 （spindle assembly checkpoint， SAC） ，會導致初級精母細胞的中期 Ⅰ停滯和死亡；相比之下，卵母細胞的第一次減數分裂的 SAC 控制，就如上面敘述的粗線期檢查點機制一樣，似乎在雌性中效率相對較低［16］。然而，重要的是，雖然第一次減數分裂時的雙極附著可能會避開SAC，但在減數分裂Ⅰ期間姐妹染色單體的過早分離使得第二次減數分裂時的非整倍體發生。

4 染色體非整倍性改變的其他效應

卵母細胞在發育過程中的長期停滯會造成高風險的 DNA 損傷。Goldmann 等［17］通過分析 1 291個親代三人組的基因組序列發現母體染色體中聚集的從頭突變的數量隨著母親年齡的增長而增加，母體成簇的從頭突變主要集中在第8、9、16號染色體，可能由母體卵母細胞中的DNA雙鏈斷裂引起。除了減數分裂，有絲分裂也會產生染色體錯誤分離的子細胞，染色體錯誤分離本身可以通過更多方式改變基因組，而不僅僅是導致染色體的增加或丟失。在異常的有絲分裂中，錯誤分離的染色體經常在后期滯后，并可能在細胞分裂期間被困在分裂溝中并被損壞，斷裂的染色體引起DNA損傷反應，在細胞周期G1期，它們通過非同源端連接進行修復，可能（但不總是）導致易位和缺失［18］。此外，落后的染色體有時也不能及時趕上其他染色體而并入重組細胞核，形成微核，微核中的DNA損傷水平很高，而這種損傷的修復會導致廣泛的DNA重排［19］。

細胞的非整倍性改變還會導致腫瘤抑制基因的缺失和癌基因的獲得，從而導致癌癥的發生［20］。例如，染色體分離錯誤會導致 p53激活，這可能是由多種機制造成的：（1）被困在細胞質溝中的染色體受損并導致 DNA 損傷檢查點通路的激活，從而激活 p53；（2）非整倍體本身通過未知機制導致 p53到 p38 的激活；（3）非整倍體會導致代謝變化，進而導致活性氧 （ROS） 增加，ROS 激活 DNA 損傷檢查點激酶共濟失調毛細血管擴張突變 （ATM），進而激活 p53；（4）長時間的分裂停滯導致 p53 激活，當細胞在前中期停滯超過 1.5 h時，細胞會在從前中期阻斷釋放時激活 p53［20］。

5 小結

人類非整倍體的起源是一個多步驟的過程，母親年齡的影響加上多次不同的“打擊”，共同增加了卵子出錯的頻率。女性胎兒卵巢中由于減數分裂前期Ⅰ的長期停滯導致了非整倍體的形成； 分裂過程中有效檢查點的缺乏；環境影響也在卵子發育的幾個不同階段起作用，從而增加了出錯的可能性［21］。綜上所述，目前我們面臨的挑戰是將這些知識轉化為改進診斷和治療，使婦女能夠對其生殖健康作出知情選擇。目前隨著人類壽命的延長，女性受教育年限的增長，女性對生殖能力和生育年齡的需求越來越高。因此，在未來，制定改善卵母細胞遺傳質量的干預措施，探討與女性生殖功能停止相關的生育和健康問題等方面都是我們需要努力的方向。