糖肝煎對2型糖尿病大鼠攝食及攝食抑制因子1、饑餓素的影響

陶毅，徐乃佳，胡愛民

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以胰島細胞損傷及胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為臨床特征的代謝性疾病［1］。T2DM慢性高血糖會對機體臟器產生長期損害，從而嚴重影響患者的生活質量［2］。研究發現，攝食過盛造成的能量代謝紊亂與糖尿病的發生密切相關，攝食抑制因子1（Nesfatin-1）是一種由核連蛋白 2（nucleobindin 2，NUCB2）水解產生的攝食抑制因子，而最近研究表明，其還具有抗高血糖的作用［3］。饑餓素（Ghrelin）作為生長激素釋放肽不僅可通過激活機體下丘腦神經回路來刺激食物的攝取，其缺失還可降低血糖并促使胰島素（insulin，INS）分泌［4］。Nesfatin-1與Ghrelin作為機體能量代謝的調控因子，可通過調控食物攝取能力來改變攝食量，從而調控機體的能量代謝，已得到多項研究證實，但關于中草藥在此方面的研究甚少［3-4］。糖肝煎是臨床中用于治療糖尿病等慢性代謝性疾病的常用藥，對T2DM的糖脂代謝具有良好的改善作用［5］，不斷深入了解其治療機制對T2DM的治療具有重要意義［1-2］。因此本研究自2021年12月至2022年2月以T2DM大鼠為對象，通過探究糖肝煎對T2DM大鼠攝食及血漿Nesfatin-1、Ghrelin水平的影響，為糖肝煎在T2DM中的治療機制研究提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物將由遼寧長生生物技術股份有限公司［許可證SCXK（遼）2020-0001］購買的50只SPF級SD大鼠（180±10）g與明暗交替12 h的環境中適應性飼養1周。本研究中對于大鼠的處理符合動物實驗倫理學相關標準。

1.2 主要試劑糖肝煎中所含藥材由武漢市中醫醫院中藥房提供；鏈脲佐菌素（STZ，常州貝源鑫生物科技有限公司，批號BYX455A）；利格列汀（5 mg，揚子江藥業集團上海海尼藥業有限公司，批號H20213378）；INS、Ghrelin試劑盒（E-EL-R2466c、EEL-R0842c，伊萊瑞特）；低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、三酰甘油（TG）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、總膽固醇（TC）（長春匯力生物技術有限公司，批號C047-a、C019-a、C046-a、C048-a）；NUCB2 試劑盒（MM-70231R2，酶免）；Nesfatin-1 ELISA試劑盒（無錫云萃生物科技有限公司YRX302227R）；Chemray240全自動生化分析儀（Rayto）；FlexStation 3多功能酶標儀（Molecular Devices）。

2 方法

2.1 糖肝煎提取濃縮糖肝煎由茯苓、白芍、茵陳、當歸、柴胡等中藥組成，其中白芍、茯苓、茵陳用水煎煮，其余打粉，混合成浸膏后0.9%氯化鈉溶液稀釋為含生藥量為0.28 g/mL及0.56 g/mL的懸濁液。

2.2 分組與T2DM模型構建將50只所購SD大鼠采用隨機數字表法隨機分成正常組（10只）、模型組（40只），構建T2DM模型大鼠：模型組大鼠連續8周給予高脂飼料喂養后，禁食12 h，尾靜脈一次性注射STZ（0.15 g/kg，由檸檬酸緩沖鹽溶液溶解），正常組大鼠飼喂基礎飼料，并注射檸檬酸鈉緩沖鹽溶液；1周后若大鼠空腹血糖（FBG）≥11.1 mmol/L，且出現三多一少（多食、多尿、多飲、體質量減輕）癥狀則造模成功［6］，成功后正常組大鼠繼續飼喂基礎飼料，模型組大鼠飼喂高脂飼料，將模型組分為T2DM組、利格列汀組（50 mg/kg利格列汀）［7］、低劑量組（2.8 g/kg糖肝煎）、高劑量組（5.6 g/kg糖肝煎）［8］，10只/組；利格列汀組、低劑量組及高劑量組連續4周分別給予相應藥物灌胃，正常組及T2DM組給予等量生理鹽水，1次/天，于實驗結束后觀察大鼠一般情況，并稱取大鼠體質量，稱量大鼠實驗結束后12 h進食量并量取實驗結束后12 h耗水量和尿量，計算各組大鼠的攝食量、攝水量、尿量。

2.3 大鼠一般指標測定于造模結束1周后抽取所有大鼠3 mL的腹主動脈血，經離心（3 000 r/min）10 min后檢測血清中FBG水平；實驗結束后再次抽取大鼠8 mL的腹主動脈血，其中3 mL經Chemray240全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中FBG、LDL-C、HDL-C、TG及TC水平（n=10），剩余5 mL用于后續ELISA實驗及qRT-PCR實驗。

2.4 大鼠口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）待取血后所有大鼠給予葡萄糖溶液（2 g/kg）灌胃，分別于15 min、0.5 h、1 h、2 h檢測大鼠各時間點的血糖水平，根據梯形公式計算OGTT曲線下區域面積（AUC）。

2.5 ELISA法檢測血清INS水平及血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平將2.2所得3 mL靜脈血樣本一部分靜置、離心（3 000 r/min）10 min后取上清液，使用ELISA檢測試劑盒測定血清INS水平，另一部分進行枸櫞酸鈉抗凝，離心、取上清液，使用NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1 ELISA檢測試劑盒測定血漿中各指標水平（n=10）。

2.6 qRT-PCR檢測血漿Nesfatin-1、GHRL表達水平按照RNA提取試劑盒實驗方法提取血漿樣本中總RNA，以其為模板，按照50 μL的反應體系反轉錄成cDNA，根據NCBI網址中Nesfatin-1、Ghrelin序列設計引物（表1），以95 ℃、3 s，60 ℃、30 s，50次循環作為反應程序進行qRT-PCR擴增，Nesfatin-1、Ghrelin 均以 GAPDH 為內參，使用 2-ΔΔCt計算 Nesfatin-1、Ghrelin表達水平（重復5次）。

表1 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）引物

2.7 統計學方法經SPSS 20.0分析，采用Shapiro-Wilk test（S-W檢驗）判定數據符合正態分布，使用±s描述，多組間比較使用單因素方差分析，多組間多時點比較采用重復測量方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況觀察正常組大鼠糞便正常，皮毛光澤順滑，行動靈活、精神狀態良好；T2DM組大鼠出現便溏，精神不振、皮毛發黃粗糙；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組大鼠上述癥狀存在不同程度改善。

3.2 糖肝煎對大鼠血清FBG、INS水平及OGTT曲線下區域面積（AUC）的影響相較于正常組，T2DM組大鼠灌胃前血清FBG水平顯著增加（P＜0.05），灌胃后血清FBG水平、OGTT AUC顯著增加，INS水平顯著降低（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組FBG水平、OGTT AUC顯著降低，INS水平顯著增加；相較于低劑量組，高劑量組血清FBG水平、OGTT AUC顯著降低，INS水平顯著增加（P＜0.05），見表2。

表2 糖肝煎對大鼠血清FBG、INS水平及OGTT AUC的影響/± s

表2 糖肝煎對大鼠血清FBG、INS水平及OGTT AUC的影響/± s

注：FBG為空腹血糖，INS為胰島素，OGTT為口服葡萄糖耐量試驗。①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數10 10 10 10 10 FBG/（mmol/L）灌胃前5.02±0.49 16.73±3.41①16.57±3.86①17.29±4.16①17.03±3.50①100.17（時間） ，56.69（組間），20.07（交互）＜0.001（時間），＜0.001（組間），＜0.001（交互）灌胃后4.76±0.30 17.01±3.22①11.27±1.15①②7.04±0.48①②③6.30±0.71②③OGTT曲線下區域面積19.40±1.48 49.28±5.03①36.17±4.05①②23.80±2.73②③21.40±3.75②③121.27＜0.001 INS/（pmol/L）26.04±1.58 5.60±1.11①10.43±1.23①②14.75±1.29①②③19.81±1.23①②③376.84＜0.001

3.3 糖肝煎對大鼠攝食量、攝水量、尿量及體質量的影響相較于正常組，T2DM組大鼠攝食量、攝水量、尿量顯著增加，體質量顯著降低（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組攝食量、攝水量、尿量顯著降低，體質量顯著增加（P＜0.05）；相較于低劑量組，高劑量組攝食量、攝水量、尿量顯著降低，體質量顯著增加（P＜0.05），見表3。

表3 糖肝煎對大鼠攝食量、攝水量、尿量及體質量的影響/± s

表3 糖肝煎對大鼠攝食量、攝水量、尿量及體質量的影響/± s

注：①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數10 10 10 10 10攝食量/（g/12h）20.59±2.53 50.70±4.22①38.97±3.22①②27.25±4.01①②③25.20±3.43①②③119.31＜0.001攝水量/（g/12h）34.03±2.75 240.92±28.34①201.20±10.12①②170.04±7.41①②③164.52±5.37①②③303.60＜0.001尿量/（mL/12h）17.40±1.52 204.33±15.03①173.99±7.22①②148.10±6.27①②③140.05±8.24①②③655.98＜0.001體質量/g 327.10±5.66 269.50±12.02①293.40±0.71①②310.50±10.02①②③307.35±1.04①②③83.49＜0.001

3.4 糖肝煎對大鼠血脂水平的影響相較于正常組，T2DM組大鼠LDL-C、TG及TC水平顯著增加，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組LDL-C、TG及TC水平顯著降低，HDL-C水平顯著增加（P＜0.05）；相較于低劑量組，高劑量組LDL-C、TG及TC水平顯著降低，HDL-C水平顯著增加（P＜0.05），見表4。

表4 糖肝煎對大鼠血脂水平的影響/（mmol/L，± s）

表4 糖肝煎對大鼠血脂水平的影響/（mmol/L，± s）

注：LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，TG為三酰甘油，TC為總膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇。①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數10 10 10 10 10 LDL-C 0.71±0.02 2.39±0.04①1.94±0.22①②1.60±0.04①②③1.13±0.14①②③304.14＜0.001 TG 0.78±0.08 2.14±0.11①1.71±0.12①②1.49±0.06①②③1.23±0.02①②③352.51＜0.001 TC 1.21±0.05 4.01±0.40①3.11±0.31①②2.14±0.10①②③1.73±0.09①②③226.82＜0.001 HDL-C 2.01±0.09 0.34±0.04①0.90±0.01①②1.27±0.12①②③1.73±0.04①②③852.23＜0.001

3.5 糖肝煎對大鼠血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平的影響相較于正常組，T2DM組大鼠血漿NUCB2、Nesfatin-1水平顯著降低，Ghrelin水平顯著增加（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組血漿NUCB2、Nesfatin-1水平顯著增加，Ghrelin水平顯著降低（P＜0.05）；相較于低劑量組，高劑量組血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平顯著增加，Ghrelin水平顯著降低（P＜0.05），見表5。

表5 糖肝煎對大鼠血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平的影響/（μg/L，± s）

表5 糖肝煎對大鼠血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平的影響/（μg/L，± s）

注：NUCB2為核連蛋白2，Nesfatin-1為攝食抑制因子1，Ghrelin為饑餓素。①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數10 10 10 10 10 NUCB2 5.16±0.47 1.12±0.28①1.92±0.23①②2.44±0.31①②③3.18±0.34①②③209.12＜0.001 Ghrelin 23.62±2.79 135.73±9.83①91.35±6.97①②67.79±6.55①②③43.88±4.62①②③436.38＜0.001 Nesfatin-1 2.10±0.23 1.38±0.20①1.69±0.13①②1.98±0.15②③2.02±0.31②③19.35＜0.001

3.6 糖肝煎對大鼠血漿Nesfatin-1、Ghrelin mRNA水平的影響相較于正常組，T2DM組大鼠血漿Nesfatin-1表達水平顯著降低，Ghrelin水平表達顯著增加（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組Nesfatin-1表達水平顯著增加，Ghrelin表達水平顯著降低（P＜0.05）；相較于低劑量組，高劑量組Nesfatin-1表達水平顯著增加，Ghrelin表達水平顯著降低（P＜0.05），見表6。

表6 糖肝煎對大鼠血漿Ghrelin、Nesfatin-1 mRNA表達水平的影響/± s

表6 糖肝煎對大鼠血漿Ghrelin、Nesfatin-1 mRNA表達水平的影響/± s

注：Ghrelin為饑餓素，Nesfatin-1為攝食抑制因子1。①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數10 10 10 10 10 Ghrelin mRNA 1.00±0.03 1.68±0.14①1.40±0.12①②1.10±0.10②③1.06±0.07②③82.45＜0.001 Nesfatin-1 mRNA 1.01±0.06 0.38±0.10①0.60±0.07①②0.89±0.08①②③0.92±0.06②③120.61＜0.001

4 討論

T2DM作為一種由INS分泌受損或IR引起的慢性代謝性疾病，會導致體內脂肪、葡萄糖、蛋白質的代謝紊亂，而長期處于高血糖水平，會造成血管、心臟、腎臟、眼等器官或組織損傷［9-10］。隨著人類生活方式及飲食的改變，由于高熱量食物的大量攝入及運動的缺乏，導致T2DM的發病率逐漸增加［11］，因此，深入了解其治療機制意義重大。

在中醫理論中，T2DM屬消渴范疇，其發病特點為：燥熱為標、陰虛為本，氣虛、陰虛、陰陽均衰、臟腑虛損［5］。糖肝煎是一種由茯苓、白芍、茵陳、當歸、柴胡等中草藥組成的中藥方劑，白芍及當歸可活血養血，茯苓可健脾，柴胡可疏肝解郁，茵陳可清熱利濕，合用具有清熱利濕、疏肝健脾的功效［12-13］。糖肝煎已在臨床上用于治療慢性代謝性疾病，其對中醫辨證為肝郁脾虛、濕熱蘊結的T2DM合并脂肪肝患者具有較好的療效［13］。有研究發現其可通過促進胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）/磷脂 酰 肌 醇 3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路激活來改善T2DM合并非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）大鼠糖脂代謝［14］。糖肝煎可通過抑制氧化應激及炎癥反應來改善T2DM大鼠NAFLD［12］。本研究造模后，模型大鼠FBG≥11.1 mmol/L，且出現三多一少癥狀表明造模成功，且低、高劑量糖肝煎可顯著降低T2DM大鼠FBG水平、OGTT AUC、攝食量、攝水量、尿量、LDL-C、TG及TC水平，增加INS水平、體質量、HDL-C水平，并且隨糖肝煎劑量的增加效果更加顯著，該結果表明糖肝煎能夠有效調節T2DM大鼠糖脂代謝及改善三多一少癥狀。

Nesfatin-1是由NUCB2水解所產生的具有82個氨基酸的肽，表達于下丘腦的特定區域，而分泌到胰島β細胞、脂肪細胞等外周組織細胞中，具有調節攝食、葡萄糖代謝等功能［15］。研究發現，妊娠期糖尿病患者血清中Nesfatin-1水平顯著降低，有作為預測妊娠期糖尿病生物標志物的潛能［16］。在糖尿病患者中Nesfatin-1循環水平顯著降低，而注射Nesfatin-1可抑制肝臟葡萄糖形成，促進葡萄糖攝取。由于Nesfatin-1具有抗高血糖及抑制食欲的作用，可有效促進糖尿病及肥胖的治療［17］。Ghrelin作為一種促食欲激素，可被存在于下丘腦、胰島、垂體等組織中的生長激素促分泌素受體-1a（growth hormone secretagogue receptor，GHSR-1a）所識別，通過相互作用來刺激機體攝入食物［18］。Ghrelin與糖尿病等代謝疾病有關，其在糖尿病大鼠血漿中水平高于正常大鼠［18-20］。本研究發現，T2DM 大鼠血漿 NUCB2、Nesfatin-1水平顯著降低，Ghrelin水平顯著增加，與前人研究結果相似［17，20］，而低、高劑量糖肝煎可顯著增加T2DM大鼠血漿NUCB2、Nesfatin-1水平，降低Ghrelin水平，并且隨糖肝煎劑量的增加效果更加顯著，該結果表明，糖肝煎抑制T2DM大鼠攝食及調節糖脂代謝的作用可能與其促進Nesfatin-1表達及降低Ghrelin表達有關。

綜上所述，糖肝煎可抑制T2DM大鼠攝食，增加其體質量及血漿Nesfatin-1水平，降低Ghrelin水平。本研究對糖肝煎在T2DM中詳細作用機制的探究具有重要意義，但由于樣本受限，目前未對其詳細的通路機制進行探究，這將成為接下來的研究重點。