長鏈非編碼RNA6030408B16RIK結合微小RNA-326-3p參與腹膜透析超濾衰竭發生的機制

李欣緒，周忠啟，王志奎，張磊，孫麗娜，蔄瑜林

終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD）發病率高、病情危重且預后較差，且家庭、社會經濟負擔高，因而一直是全球關注的重要衛生問題［1］。腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）以清除腎損傷病人尿毒癥毒素的方式改善腹膜透析病人生活質量［2-3］。目前的統計表明，中國過去十年間腹膜透析的使用率急劇上升（超過10倍）［1］。但長期接觸生物不相容性的腹透液會導致明顯的腹膜纖維化（peritoneal fibrosis， PF），這些變化包括腹膜間皮細胞間充質轉分化、細胞外基質沉積致間皮細胞下層增厚以及血管生成。并且高糖溶液能夠引起腹膜組織發生上皮細胞向間充質細胞轉化（epithelial-musenchymal transdifferentiation，EMT）［4］。反復發生腹膜炎、腹膜纖維化易致腹膜損傷后超濾衰竭（ultrafiltration failure， UFF），成為目前退出腹膜透析最主要、最常見的原因之一。據研究，包括LncRNA、miRNA等內的非編碼RNA參與了腹膜透析的超濾衰竭［5-8］。劉瑩等［9］報道，LncRNA NEAT-1通過miR-34a激活PI3KAKT信號通路影響上皮間質轉分化。本課題組通過生物學預測網站預測了LncRNA6030408B16RIK與miR-326-3p之間的結合位點，并且前期實驗已經證實LncRNA6030408B16RIK的表達下調可能改善了腹膜纖維化進程延緩了超濾衰竭的發生。本實驗目的在于使用雙熒光素酶報告實驗以及RNA pull down實驗研究LncRNA6030408B16RIK與miR-326-3p的靶向關系，在超濾衰竭的生發、始動環節進行預防，為保護腹膜功能提供新的靶點和思路。本研究于2019年7月至2020年6月通過雙熒光素酶報告實驗以及RNA pull down實驗驗證LncRNA6030408B16RIK結合miR-326-3p參與腹膜透析超濾衰竭發生的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料36只使用5/6腎臟切除術造模成功的尿毒癥模型Sprague Dawley大鼠，體質量為185～200 g（廣東省醫學實驗動物中心，動物許可證號SCXK，粵2013-0002）。3%戊巴比妥鈉麻醉注射液、3%H2O2（美 國 Sigma-Aldrich Chemical Company），4.25%腹透液、一抗兔抗膠原Ⅲ抗體、二抗山羊抗兔免疫球蛋白G（英國Abcam Inc，Cambridge），兔源抗Collagen Ⅲ、CD31抗體，miR-326-3p模擬物、miR-326-3p抑制劑和NCs（廣州RiboBio Co，Ltd.）。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 實驗方法

1.2.1 尿毒癥模型構建及分組 選取40只正常喂養1周的大鼠參照文獻［10-11］進行尿毒癥模型構建，首先抽取大鼠尾部血測正常肌酐值，后用3%戊巴比妥鈉麻醉，碘伏液消毒，選擇左側距離肋下肌約1.5 cm，平行于脊柱旁開1 cm的位置行縱行切口，依次切開大鼠的皮膚、筋膜層及肌層，識別左側腎臟。后充分分離腎臟周圍組織，結扎后將左側腎臟的上1/3和下1/3一起取出，后用明膠海綿壓迫止血，檢查無出血后，逐層縫合切口。1周后以同樣方法行右側腎臟切除，確定右側腎臟準確位置后，用絲線于腎門處結扎腎臟，后從結扎處切下右腎，檢查確認無出血后，依次縫合肌層及皮膚。2次手術后都給予青霉素注射3日預防感染發生。造模手術4周后，抽取大鼠尾血測肌酐值，測量為正常值的2～3倍者則造模成功。造模手術過程中2只大鼠死亡，后有2只死于腹膜炎，將構建成功的36只大鼠尿毒癥模型分為六組，每組6只大鼠（不成功大鼠已經剔除），分別為：尿毒癥組（不進行腹膜透析治療），空白組（腹膜透析4周），NC組（腹膜透析4周+轉染空質粒），inhibitor NC組（腹膜透析4周+轉染空質粒抑制劑），miR-326-3p mimic組（腹膜透析4周+miR-326-3p模擬物），miR-326-3p inhibitor組（腹膜透析4周+miR-326-3p抑制劑）。

1.2.2 腹膜平衡試驗（PET） 大鼠腹膜透析誘導結束2 d后，將2 mL 4.25%的腹膜透析液注入大鼠腹腔中，并留取0.1 mL測量0 h大鼠的超濾量及葡萄糖轉運量。透析2 h后，沿腹白線行一切口打開腹腔，抽取其中的腹透液，而后準確量取腹透液量，并用紗布吸凈腹腔內殘余液體，稱重，后計算超濾量及葡萄糖轉運量。計算方法：超濾量（ultrafiltration，UF）=（總出量-入量）mL；葡萄糖轉運量（mass transfer of glucose，MTG）=（葡萄糖濃度-初始×透析液量-初始）-（葡萄糖濃度-透析末×透析液量-透析末）mmol/kg。

1.2.3 HE染色 處死大鼠后收集腹膜組織，切片制作完成后室溫下干燥1.5 h。過濾去除氧化的雜質，經蘇木精染色液染色5 min后，浸泡入蒸餾水中洗去多余的染色液，后以1%的鹽酸乙醇分化5 s。將樣品置于流水中至少洗滌30 min，直到細胞變藍。用1%曙紅染液染色1 min后，依次在梯度乙醇（70%、80%、95%、100%）中脫水，分別用 95% 和100%乙醇洗滌2次，每次5 min。然后經二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）清洗，各5 min，擦去多余的二甲苯，并在二甲苯干燥前以中性膠密封，蓋上蓋玻片干燥過夜。使用直立顯微鏡觀察樣品，并用CTS成像系統記錄照片。

1.2.4 Masson染色 切片脫蠟后，依次經自來水、蒸餾水洗滌，細胞核用Regaud蘇木精染液染色。水洗后，將切片在Ponceau酸液中浸泡8 min，在2%冰醋酸溶液中浸泡1 min。甩干玻片上的水分后以1%磷鉬酸水溶液分化4 min，擦掉多余液體后，用苯胺鹽染色5 min。將切片置于0.2%冰醋酸溶液和95%無水乙醇中浸泡2 min，以去除多余染液。最后，經二甲苯清洗后，以中性樹膠封固。

1.2.5 免疫組化 將切片于60 ℃的恒溫箱里加熱1 h，浸入二甲苯溶液中脫蠟，而后依次置于梯度乙醇中脫水，然后在37 ℃的3%H2O2中孵育30 min，經磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，浸入95 ℃的1%檸檬酸緩沖液中煮沸20 min。冷卻至室溫后，切片用PBS沖洗，在37 ℃下用山羊血清封閉10 min，后加入一抗兔抗膠原Ⅲ抗體，于4 ℃下放置12 h。然后PBS沖洗后，加入二抗山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG），于37 ℃下孵育10 min。在標本中滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素溶液，并孵育10 min。然后將DAB顯色劑加入樣本中，置于室溫暗室中顯色8 min。切片用蘇木精復染，脫水封片后，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗 使用生物學預測網站（https：//cm.jefferson.edu/rna22/）進行 miR-326-3p與LncRNA6030408B16RIK的結合位點分析，并獲取含有作用位點的片段序列。克隆LncRNA603040 8B16RIK的全長到pmirGLO Luciferase載體上，命名為pLncRNA6030408B16RIK-Wt。利用生物信息軟件預測miR-326-3p與LncRNA6030408B16RIK的結合位點，定點突變。構建pLncRNA6030408B16RIKMut載體，將 miR-326-3p 模擬物及 miR-326-3p 陰性對照物分別與熒光素酶報告載體共轉染入HEK-293T細胞，然后用熒光檢測儀器檢測熒光強度。

1.2.7 RNA Pull Down實驗 將50 nmol/L生物素化的Wt-miR-326-3p和Mut-miR-326-3p轉染到大鼠腹膜間皮細胞。48 h后，收獲細胞并在特異性裂解緩沖液中孵育10 min。將細胞裂解物與預涂有無RNase的牛血清白蛋白（BSA）和酵母轉移RNA（tRNA）的M280鏈霉親和素磁珠一起孵育。然后將小珠在4 ℃下孵育3 h，加入預冷的細胞裂解液洗滌2次。將小珠分別經低鹽緩沖液洗滌3次，再用高鹽緩沖液洗滌1次。通過Trizol試劑純化的RNA，經實時定量PCR以檢測LncRNA6030408B16RIK的富集。

1.2.8 實時定量PCR 使用Trizol試劑提取大鼠腹膜間皮細胞和大鼠腹膜組織中的RNA，讀取260 nm及280 nm處分光光度計值，后用Nano Drop2000測定RNA的濃度和純度。采用primer5.0和mirprimer2軟件設計RT-qPCR的引物，確認后由上海吉瑪有限公司（中國上海）合成。使用ABI PRISM 7500系統進行RT-qPCR。內參選用β-肌動蛋白和U6，并計算目標基因的表達。

1.2.9 蛋白質印跡法（Western blotting） 從大鼠腹膜間皮細胞和大鼠腹膜組織中提取總蛋白質，用二辛可寧酸（BCA）試劑確定每個蛋白質的濃度。蛋白質經10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，在100 mV的恒定壓力下使用濕轉移法將印跡轉移到PVDF膜上。加入濃度5%BSA，室溫下封閉1 h，然后用抗β-肌動蛋白、α-SMA的一抗兔抗體在4℃下封閉過夜。洗滌后，加入二抗山羊抗兔IgG，并在室溫下孵育1 h，然后使用化學發光試劑顯影。使用Image J軟件來量化譜帶強度。β-肌動蛋白用作內參，靶條帶與β-肌動蛋白的灰度值之比表示相對蛋白表達。

1.3 統計學方法本課題分析數據使用SPSS 21.0軟件。服從正態分布和方差均勻性的數據表示為±s。使用獨立樣本的t檢驗比較兩組之間的數據，而用單因素方差分析比較多組之間的數據，而后進行Tukey后檢驗。P＜0.05時為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 下調miR-326-3p對腹膜組織結構及功能變化和腹膜纖維化的影響（1）腹膜透析4周后，通過HE染色、Masson染色、免疫組化的實驗結果觀察腹膜組織結構發生的變化，與inhibitor NC組相比，miR-326-3p inhibitor組細胞變為明顯的圓形，間皮基質增加并伴有許多成纖維樣細胞；相反，與mimic NC組相比，miR-326-3-p mimic組的尿毒癥大鼠間皮細胞成規律的扁平狀，無明顯巨噬細胞浸潤及膠原纖維沉積。此外，miR-326-3p mimic組大鼠的腹膜厚度降低，膠原蛋白Ⅲ和CD31表達量下降，而miR-326-3p inhibitor組腹膜厚度增加，膠原蛋白Ⅲ和CD31陽性表達量明顯增加。見表1。

表1 大鼠腹膜形態比較/± s

表1 大鼠腹膜形態比較/± s

注：①與模擬物空白組相比，P＜0.001。②與抑制物空白組相比，P＜0.001。

組別mimic NC組miR-326-3p組inhibitor NC組miR-326-3p inhibitor組F值P值鼠數6 6 6 6腹膜厚度/mm 18.57±1.95 13.11±1.36①17.32±1.88 27.18±2.82②48.84＜0.001 CollagenⅢ/%22.44±2.45 6.44±0.74①20.09±3.08 44.69±5.12②142.56＜0.001 CD31/%14.22±5.04 3.94±0.82①16.49±5.63 32.60±5.48②38.43＜0.001

（2）通過腹膜平衡實驗觀察腹膜功能變化，miR-326-3p mimic組大鼠的超濾能力較mimic NC組明顯增加，葡萄糖轉運量明顯下降；而miR-326-3p inhibitor組相比inhibitor NC組，超濾量明顯下降，而葡萄糖轉運量增加。見表2。

表2 大鼠腹膜超濾量及葡萄糖轉運量/± s

表2 大鼠腹膜超濾量及葡萄糖轉運量/± s

注：MTG為葡萄糖轉運量。①與模擬物空白組相比，P＜0.001。②與抑制物空白組相比，P＜0.001。

組別mimic NC組miR-326-3p組inhibitor NC組miR-326-3p inhibitor組F值P值鼠數6 6 6 6超濾量/mL 5.10±0.52 7.02±0.71①5.12±0.52 3.01±0.31②56.12＜0.001 MTG/（mmol/kg BW）12.54±1.27 6.12±0.65①12.16±1.24 19.64±1.99②97.28＜0.001

（3）RT-PCR和Western blotting的結果顯示，miR-326-3p mimic組中，間皮細胞轉分化的標志物α-SMA、FSP1和波形蛋白表達下降，E-鈣黏蛋白表達增加，在miR-326-3p inhibitor組中結果相反。見表3，表4。

表3 大鼠腹膜中mRNA的表達水平/± s

表3 大鼠腹膜中mRNA的表達水平/± s

注：FSP1為成纖維細胞特異性蛋白-1，α-SMA為α-平滑肌肌動蛋白，Vimentin為波形蛋白，E-cadherin為E-鈣黏蛋白。①與模擬物空白組相比，P＜0.001。②與抑制物空白組相比，P＜0.001。

組別mimic NC組miR-326-3p組Inhibitor NC組miR-326-3p inhibitor組F值P值鼠數6 6 6 6 FSP1 1.02±0.14 0.38±0.04①1.01±0.12 1.69±0.18②104.26＜0.001 α-SMA 0.99±0.10 0.42±0.04①1.03±0.12 1.54±0.16②103.95＜0.001 Vimentin 1.00±0.10 0.59±0.06①0.99±0.10 1.63±0.17②88.87＜0.001 E-cadherin 1.01±0.12 1.90±0.19①1.02±0.12 0.58±0.05②108.05＜0.001 miR-326-3p 1.01±0.13 2.56±0.26①1.01±0.11 0.31±0.04②221.15＜0.001

表4 大鼠腹膜中蛋白質的表達水平/± s

表4 大鼠腹膜中蛋白質的表達水平/± s

注：α-SMA為α-平滑肌肌動蛋白，FSP1為成纖維細胞特異性蛋白-1，Vimentin為波形蛋白，E-cadherin為E-鈣黏蛋白。①與模擬物空白組相比，P＜0.001。②與抑制物空白組相比，P＜0.001。

組別mimic NC組miR-326-3p組inhibitor NC組miR-326-3p inhibitor組F值P值鼠數6 6 6 6 α-SMA 0.81±0.09 0.51±0.06①0.92±0.09 1.57±0.16②107.78＜0.001 FSP1 0.62±0.08 0.22±0.03①0.64±0.07 1.16±0.18②82.80＜0.001 Vimentin 0.96±0.10 0.61±0.06①0.92±0.10 1.72±0.17②101.60＜0.001 E-cadherin 1.14±0.14 1.99±0.21①1.14±0.15 0.62±0.06②85.01＜0.001

2.2 LncRNA6030408B16RIK與miR-326-3p靶向關系驗證通過生物學預測網站分析miR-326-3p與LncRNA6030408B16RIK的結合位點，雙熒光素酶實驗結果顯示與miR-326-3p mimic相結合的LncRNA6030408B16RIK-Wt的熒光帶強度明顯下降，而LncRNA6030408B16RIK-Mut的強度相較于NC組則無明顯變化；RNA pull down實驗中，與Wt-miR-326-3p結合的LncRNA6030408B16RIK富集量明顯高于Mut-miR-326-3p組。結果說明LncRNA603040 8B16RIK特異性結合miR-326-3p。見表5，6。

表5 與miR-326-3p結合LncRNA6030408B16RIK的熒光強度/± s

表5 與miR-326-3p結合LncRNA6030408B16RIK的熒光強度/± s

組別mimic NC組miR-326-3p組F值P值鼠數6 6 pWt-LncRNA60304 08B16RIK 1.01±0.11 0.49±0.05 53.88＜0.001 pMut-LncRNA6030 408B16RIK 1.03±0.12 1.00±0.10 0.09＜0.001

表6 與LncRNA6030408B16RIK結合miR-326-3p的富集量/± s

表6 與LncRNA6030408B16RIK結合miR-326-3p的富集量/± s

注：①與空白組相比，P＜0.001。

組別NC組Wt-miR-326-3p組Mut-miRNA-326-3P組F值P值鼠數6 6 6 miR-326-3p 1.01±0.12 2.87±0.29①1.02±0.12 90.98＜0.001

3 討論

腹膜透析 （PD） 是終末期腎病治療常用的重要連續替代方案，在生存、病人獨立性和醫療保健成本方面具有相當大的初始益處［3］。然而，其更廣泛使用的障礙之一是基于葡萄糖的PD溶液由于纖維化對腹膜的形態完整性和功能產生影響。主要是由高糖刺激引起的，通過激活多種細胞因子和轉錄因子信號通路影響膠原蛋白和其他細胞外膜成分的合成，使腹膜發生上皮間充質轉分化，致超濾衰竭的發生，但具體機制尚不清楚［12］。越來越多的證據證明了不同類別的非編碼 RNA （ncRNA）在腹膜纖維化中的調節作用。miRNA屬于一類獨特的ncRNA，目前研究顯示miRNA通過介導多種信號通路參與了上皮間質轉分化過程［13-16］。miR-326-3p在腎臟腫瘤疾病中對細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡有重要影響，且在一些女性相關疾病（包括宮頸癌、子宮內膜癌、乳腺癌和多種自身免疫性疾病）中存在異常表達［17-20］。本課題探討了miR-326-3p是否通過EMT參與了腹膜纖維化過程，HE染色、Masson染色、免疫組化結果表明miRNA-326-3p mimic組細胞排列規則，形態呈扁平狀，無明顯間皮細胞脫落、間質增厚、巨細胞浸潤表現；而miRNA-326-3p inhibitor組中作為間皮細胞轉分化標志物的α-SMA和波形蛋白表達上調，而E-鈣黏蛋白表達下調說明發生了腹膜纖維化。Katsunori等［21］發現，與正常小鼠相比，腹膜纖維化的小鼠中miRNA表達異常。大量研究表明miR-15b、miR-21促進腹膜纖維化的發生，而miR-200c、miR-29b和miR-30a則一定程度上抑制纖維化的發生［13］。這些研究間接驗證了我們的實驗中miRNA-326-3P過表達可延緩腹膜纖維化的進程。

本課題組前期實驗已經證實下調LncRNA6030 408B16RIK的表達可延緩大鼠超濾衰竭的發生，且經生物學預測網站分析LncRNA6030408B16RIK與miRNA-326-3p存在靶向結合位點。有研究顯示LncRNA結合miRNA介導不同的通路，調節下游蛋白質的表達，對細胞的增殖、轉移和上皮間質轉分化產生影響［22-28］。本實驗采用 RT-PCR、Western blotting等方法，檢測大鼠腹膜組織中LncRNA6030408B 16RIK與miR-326-3p相關基因和蛋白的表達水平，且通過雙螢光素酶實驗對LncRNA6030408B16RIK與miR-326-3p的靶向關系進行研究。結果顯示miR-326-3p mimic組與mimic NC組相比LncRNA6030408B16RIK-Wt富集量明顯升高，而LncRNA6030408B16RIK-Mut的富集量在兩組中差異無統計學意義；且與NC組以及LncRNA6030408B16 RIK-Mut組相比，miR-326-3p與LncRNA6030408B16 RIK-Wt相結合的熒光強度明顯下降，說明LncRNA6030408B16RIK與miR-326-3p存在相互作用。通過本實驗可得出結論，LncRNA6030408B16RIK通過結合miR-326-3p參與腹膜透析大鼠的超濾衰竭，過表達miR-326-3p可一定程度上抑制尿毒癥大鼠腹膜透析超濾衰竭的發生，或可為我們預防超濾衰竭延緩腹膜纖維化提供新的思路。目前有文獻表明mi-RNA可調控WISP因子影響足細胞的上皮間質轉分化以及器官的纖維化［29-31］。目前經過生物預測網站分析，miR-326-3p與WISP因子存在靶向結合位點，可在以后閱讀大量文獻后，設計更加科學的實驗以此作為進一步研究的方向。