辣椒鋅指蛋白DnaJ-Like基因家族鑒定及對高溫脅迫的表達響應

段敏杰 李怡斐 楊小苗 王春萍 黃啟中 黃任中 張世才

（1.重慶市農業科學院蔬菜花卉研究所，重慶 401329；2.重慶市農業科學院生物技術研究所，重慶 401329）

DnaJ 蛋白是一類分子量為41 kD 的熱激蛋白（Hsp40），最早在大腸桿菌（Escherichia coli）中發現，又稱為J-蛋白［1］。J-蛋白通常包含4 個功能結構域：N 末端J-結構域、G/F 結構域、鋅指結構域（CxxCxGxG）及羧基末端區［2-3］。其中J-結構域具有極其保守的組氨酸/脯氨酸/天冬氨酸（His/Pro/Asp，HPD）三肽，是J-蛋白最核心特征［4］。J-蛋白通常作為伴侶蛋白，與熱激蛋白HSP70 結合，參與蛋白質折疊、展開、組裝和降解，并維持蛋白質穩定［5］。然而越來越多的研究發現DanJ 蛋白的一些活性并不依賴于完整的J-結構域，如當HPD 三肽發生突變甚至缺失的情況下，DanJ 蛋白仍能保持其活性［6-7］，這類蛋白被劃分至J-Like 蛋白。依據擬南芥（Arabidopsis thaliana）的分類方式［8］，該類蛋白可分為三類：具有類似J-結構域的DNAJD 蛋白，具有類似鋅指結構域和C 末端結構域的DNAJF 蛋白，具有位于羧基端重復DnaJ CxxCxGxG 或GRXLike（GRL）CxxCx7CxxC 鋅指結構域的DnaJ-like 鋅指蛋白（DNAJE）［8-12］，DNAJE 蛋白是目前研究最多、最為復雜的一類J-Like 蛋白。

已有研究表明，DNAJE 蛋白在植物光合復合體組裝中發揮重要作用，而光合復合體組裝對環境干旱、溫度、光照等的改變非常敏感，每一種變化都會引起植物氧化還原反應的失衡，進而影響植物抗逆性［13］。最早在玉米（Zea maysL.）中鑒定到一個DNAJE基因BSD2［14］，之后在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中鑒定到同源BSD2基因［15］，該基因能夠通過轉錄后調控rbcl 蛋白，從而促進葉綠體功能的正常發揮。同時，在擬南芥［16-20］、百脈根（Lotus corniculatusL.）［20］等中也鑒定到CYO1、SCO2、ANGULATA7等DNAJE基因，其均與葉綠體發育相關，在維持氧化還原反應和光合作用平衡中發揮作用。Fristedt 等［21］和Lu等［22］研究也發現，DNAJE 蛋白在光系統Ⅱ的維護和光系統Ⅰ積累中發揮特殊作用。目前，所有分離鑒定已知功能的DNAJE 蛋白中，僅THRUMIN1 屬于GRL CxxCx7CxxC 型，其他均為DnaJ CxxCxGxG 型鋅指蛋白［23］。

植物生長發育過程中會遭受諸多不利環境因子脅迫，如高溫、低溫、干旱、鹽等，導致正常生長發育受阻，從而影響產量和品質［24］。辣椒（Capsicum annuum）為一年生或多年生茄科（Solanaceae）作物，是全球種植面積最大的蔬菜作物和消費量最大的辛辣調味品［25］。辣椒喜溫不耐熱，最適生長溫度為22-28℃，溫度超過32℃，會產生不可逆熱害癥狀，導致其生長發育不良，造成減產，嚴重制約辣椒產業發展［24］。目前在辣椒中還未見DNAJE基因家族的相關報道，辣椒全基因組測序數據［26］的公布為辣椒DNAJE基因家族的鑒定和分析提供了條件。

本研究對辣椒DNAJE基因家族進行鑒定，系統分析基因結構特點、進化關系、啟動子順式作用元件、共線性關系及不同組織器官的表達模式等，并研究其在高溫脅迫下的生理生化和基因表達特征，為進一步探究辣椒DNAJE基因響應高溫脅迫機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為課題組耐熱育種骨干親本862。挑選籽粒飽滿一致的辣椒種子，播種于10 cm ×10 cm營養缽中，溫室育苗。待幼苗長至5-6 片真葉時轉入光照培養箱適應性生長，晝夜溫度/光周期設定為26℃/12 h 和22℃/12 h，光照強度4 000 lx，每日定時澆水，控制空氣相對濕度為70%。培養3 d 后調整培養箱晝夜溫度至40℃/30℃，進行高溫脅迫處理，對照組為26℃/22℃，光周期、光照強度、空氣相對濕度保持不變。分別于處理0、1、3、5、7、10 d 時取葉片經液氮速凍后，-80℃保存備用。每次取樣隨機選擇10 株，重復3 次。

1.2 方法

1.2.1 辣椒DNAJE基因家族鑒定和特征分析 從國家基因庫核酸序列歸檔系統（CNSA）（https://db.cngb.org/cnsa/）和茄科基因組數據庫（https://www.sgn.cornell.edu/） 分別下載辣椒Zunla 1 和番茄（Solanum lycopersicumL.）全基因組數據，構建本地蛋白數據庫；從Pfam 數據庫（https://pfam.xfam.org/）獲得鋅指（zinc finger）結構域DnaJ_CxxCxGxG HMM 模型文件PF00684，通過本地Hmmsearch 命令初步篩選獲得DNAJE基因家族成員；參考已發表文獻［8,10］從擬南芥數據庫（https://www.arabidopsis.org/）獲得33 個擬南芥DNAJE基因家族成員蛋白序列，與辣椒和番茄蛋白序列進行本地Blastp 比對，收集E-value<1e-5 輸出基因，剔除重復序列后，與HMM 檢索結果合并；將合并的候選序列上傳至Pfam、NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）及SMART（http://smart.emblheidelberg.de/），基于DNAJE 結構域進一步比對篩選。利用ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）計算辣椒DNAJE 蛋白分子量和等電點，利用WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）在線分析工具進行DNAJE 蛋白的亞細胞定位預測；利用在線軟件SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測分析DNAJE 蛋白二級結構。

1.2.2 辣椒DNAJE基因家族染色體定位和比較進化關系分析 基于獲取的辣椒基因組注釋信息文件，利用TBtools［27］可視化工具構建辣椒染色體定位圖；利用MEGA 5.0 軟件的鄰近法（neighbour-joining,NJ）構建辣椒、番茄和擬南芥DNAJE 進化樹，設置Bootstrap 值為1 000，置換模型為P-distance，其他為默認參數；利用在線軟件iTOL（http://itol.embl.de/）對進化樹進行美化。

1.2.3 辣椒DNAJE基因家族保守基序、基因結構、啟動子作用元件分析 利用MEME（https://memesuite.org/meme/tools/meme） 在線軟件預測分析DNAJE 蛋白保守motif，motif 最大發現數設定為5個，其他參數默認。利用TBtools 軟件分析DNAJE基因結構，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件分析基因啟動子順式作用元件，利用MEGA 5.0 構建辣椒DNAJE基因家族系統進化樹，方法參數同上，利用TBtools 軟件對上述結果進行可視化。

1.2.4 辣椒和擬南芥DNAJE基因家族共線性及RNA-seq 分析 利用TBtools 軟件中Fasta stats 和Table Row 功能構建辣椒和擬南芥染色體骨架、DNAJE基因位置，再利用其One step MCscanX（Super Fast）和Advanced circos 插件對辣椒和擬南芥進行共線性分析；從NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45037） 下載葉、花、莖、根及不同時期果實的RNA-seq 數據，提取DNAJE基因家族成員TPM 值并繪制基因表達熱圖。

1.2.5 辣椒高溫脅迫響應相關基因RT-qPCR 分析 利用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme）提取樣品總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 質量，NanoDrop 2000 超微量分光光度計檢測RNA 濃度，利用Hiscript Ⅲ 1st strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）試劑反轉錄合成cDNA；利用Primer 5.0 設計特異性引物，并在NCBI Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）進行特異性驗證，以UBI3為內參基因（表1）。參照ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）試劑操作說明書進行RT-qPCR 分析。采用2-△△Ct算法計算基因相對表達量，使用EXCEL、Origin 2021、SPSS 18.0 軟件進行數據分析及作圖。

表1 實時熒光定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.2.6 高溫脅迫下辣椒幼苗的生理生化響應 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、過氧化物酶（peroxidase,POD）和過氧化氫酶（catalase,CAT）活性及丙二醛（malondialdehyde,MDA）、過氧化氫（hydrogen peroxide,H2O2）含量測定參照試劑盒說明書（蘇州科銘生物技術有限公司）進行操作，采用Thermo MULTISKAN GO 型酶標儀分別測定不同波長下吸光度，計算酶活性或含量，利用EXCEL、Origin 2021 進行數據分析及作圖。

2 結果

2.1 辣椒DNAJE基因家族鑒定與分析

本研究在Zunla 1 和番茄基因組中分別鑒定獲得28 個和26 個DNAJE基因家族成員，依據其在染色體上的位置將辣椒DNAJE基因命名為CaDNAJE1-CaDNAJE28。對所有CaDNAJE 蛋白理化性質分析結果（附表1）顯示，CaDNAJE基因序列開放閱讀框（ORF）長度范圍為297-1 410 bp，變化范圍較大。CaDNAJE 蛋白氨基酸序列長度在99（CaDNAJE23）-470（CaDNAJE18）個之間，分子量變化范圍為10.05（CaDNAJE23）-52.26（CaDNAJE18）kD，理論等電點（pI）為4.75（CaDNAJE7）-9.64（CaDNAJE20）。亞細胞定位預測發現，CaDNAJE 蛋白主要定位在葉綠體、細胞核及細胞質。二級結構分析表明（附表2），28 個CaDNAJE 蛋白二級結構完整，以無規卷曲（random coil）和α-螺旋（α-helix）為主。

2.2 辣椒DNAJE基因家族染色體定位和進化關系分析

28 個CaDNAJE基因不均勻分布在辣椒除7 號和8 號染色體之外的10 條染色體上，另外有3 個基因未錨定在染色體上（圖1）。其中，1 號和9 號染色體上分布最多，均有5 個；3 號和11 號染色體上各包含3 個；2 號、6 號和10 號染色體上各有2 個；而4 號、5 號和12 號染色體上只有1 個成員。

圖1 辣椒DNAJE 基因家族成員染色體定位Fig.1 Chromosomal location of DNAJE gene family members in pepper（Capsicum annuum）

為探討辣椒、番茄和擬南芥DNAJE基因家族成員之間的進化關系，構建了28 個辣椒、26 個番茄和33 個擬南芥DNAJE 蛋白的系統進化樹（圖2）。進化結果分為2 個亞族，Group Ⅰ和 Group Ⅱ。Group Ⅰ 有16 個辣椒成員、15 個番茄成員和20 個擬南芥成員，屬于DNAJ CxxCxGxG 型DNAJE 鋅指蛋白。Group Ⅱ 中有12 個辣椒成員、11 個番茄成員和13 個擬南芥成員，屬于GRL CxxCx7CxxC 型DNAJE 鋅指蛋白。

圖2 辣椒、擬南芥和番茄DNAJE 基因家族成員進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of DNAJE gene family members in pepper,Arabidopsis and tomato（Solanum lycopersicum）

2.3 辣椒DNAJE基因家族成員保守基序、順式作用元件及基因結構分析

基于MEME 在線分析軟件，在CaDNAJE 蛋白中分析了5 個保守motif（圖3-B），基序長度介于15-45 個氨基酸之間（表2）。系統進化樹分析結果顯示（ 圖3-A），Group Ⅰ 中CaDNAJE13 和CaDNAJE25 分別缺失motif 2 和motif 5 基序，其他10 個成員均包含motif 1-motif 5 保守基序；Group Ⅱ所有16 個成員均缺失motif 2、motif 3 和motif 5，只包含motif 1 和motif 4 保守基序。

表2 辣椒DNAJE 蛋白氨基酸保守基序Table 2 Conserved motif of the DNAJE proteins in pepper

基因結構分析表明（圖3-C），同一亞族內成員具有相似的基因結構，但不同亞家族間基因結構和內含子數目存在明顯差異。Group Ⅰ 中除CaDNAJE2和CaDNAJE26外，均只包含1 個外顯子，大部分成員無內含子；Group Ⅱ 中成員具有0-11 個內含子，其中具有4 個以上內含子的占比為56%，CaDNAJE19和CaDNAJE16內含子數目最多，CaDNAJE23和CaDNAJE20只包含1 個內含子，CaDNAJE27無內含子。

利用在線工具對該家族基因啟動子順式作用元件進行預測，結果如圖3-D 所示。多個CaDNAJE基因啟動子區富集了光響應（GATA-motif、G-box）、MeJA 響應（TGACG-motif）、脫落酸響應（ABRE）、水楊酸響應（TCA-element）、MYB 結合位點參與干旱誘導（MBS）、低溫響應（LTR）、防御與脅迫響應（TC-rich repeat）、晝夜節律調節（circadian）等順式作用元件。其中，TGACG-motif 和ABRE 較多，而MSA-like 和TGA-element 分別僅在CaDNAJE15和CaDNAJE20中被檢測到。

圖3 辣椒DNAJE 基因家族保守基序、基因結構和順式作用元件分析Fig.3 Analysis of conserved motifs,gene structure and cis-acting elements of DNAJE gene family in pepper

2.4 辣椒與擬南芥DNAJE基因家族成員共線性分析

共線性分析結果（圖4）顯示，辣椒和擬南芥之間有10 對DNAJE共線性基因，辣椒中9 個對應擬南芥中10 個DNAJE基因。分別為CaDNAJE1/AT4G10630、CaDNAJE4/AT5G06470、CaDNAJE4/AT3G11773、CaDNAJE7/AT3G28850、CaDNAJE8/AT5G61670、CaDNAJE10/AT4G13670、CaDNAJE11/AT1G75690、CaDNAJE13/AT5G58530、CaDNAJE18/AT5G03870、CaDNAJE21/AT2G41330 直系同源基因對。其中，CaDNAJE4基因在擬南芥中有2 個共線性基因，表明該基因發生了擴張。此外，在辣椒中僅有CaDNAJE12/CaDNAJE21之間存在共線性關系，表明該基因家族種內共線性基因較少。

圖4 辣椒和擬南芥DNAJE 基因家族共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of DNAJE gene family between pepper and Arabidopsis

2.5 辣椒DNAJE基因家族表達模式分析

利用GEO Datasets 中的轉錄組數據，對辣椒DNAJE基因家族組織特異性表達模式進行分析，結果如圖5。辣椒DNAJE基因在不同組織及果實中有明顯表達差異，28 個基因可以分為4 類。CaDNAJE1、CaDNAJE4、CaDNAJE6等A 類基因在辣椒各組織中表達量都很低甚至不表達，多數為Group Ⅱ 基因；B 類4 個基因中僅CaDNAJE26在葉和花芽中表達量相對較高；C 類CaDNAJE 5、CaDNAJE 27、CaDNAJE 23等基因在花和幼果中高表達；D 類基因多數為Group Ⅰ 基因，除CaDNAJE2、CaDNAJE10、CaDNAJE20在0-1 cm 幼果或葉和花芽中幾乎不表達外，其他基因在各組織中均高表達。

圖5 DNAJE 基因在辣椒不同組織及果實發育過程中的表達分析Fig.5 Expression profile analysis of pepper DNAJE genes in different tissues and fruit development

2.6 辣椒高溫脅迫響應基因的表達分析

通過分析NCBI SRA 數據庫中辣椒高溫脅迫轉錄組數據（SRP187794），對表達顯著差異的12 個CaDNAJE基因和3 個Hsf/HSP 耐熱相關基因進行高溫脅迫RT-qPCR 分析（圖6）。其中，CaHSP22、CaHSP16.4和CaHsfB5基因受高溫脅迫表達水平極顯著升高，隨脅迫時間延長，CaHSP22、CaHSP16.4表達呈下降趨勢；辣椒DNAJE基因中除CaDNAJE24負向調控辣椒響應高溫脅迫，表達水平下調外，其他11 個基因均呈現不同程度的上調表達，但在不同脅迫時期的表達模式有所差異。CaDNAJE2、CaDNAJE3、CaDNAJE13和CaDNAJE21這4 個基因在1 d 時表達水平最高，之后呈下降趨勢；CaDNAJE11基因在1、7 和10 d 時表達水平均顯著高于對照，且在7 d 時表達水平最高；CaDNAJE15基因在脅迫1、3、5 d 時表達水平基本持平，之后降低；CaDNAJE17、CaDNAJE19、CaDNAJE23和CaDNAJE27這4 個基因表達基本呈現先升后降再升趨勢，均在5 d 時達到最高。CaDNAJE基因在高溫脅迫下的高表達，表明其作為應激蛋白可能在辣椒響應高溫脅迫中起調節作用，以維持辣椒正常的生長發育。

圖6 辣椒高溫脅迫相關基因表達分析Fig.6 Expression analysis of genes related to high temperature stress in pepper

2.7 高溫脅迫下辣椒幼苗的生理生化響應

當植物遭遇高溫等逆境脅迫時，會造成體內H2O2積累，威脅植物細胞膜系統，導致膜脂過氧化產物MDA 含量升高。同時，植物自身SOD、POD、CAT 等抗氧化保護酶系統啟動，參與植物對外界逆境脅迫的響應。由圖7可知，隨著高溫脅迫時間延長，H2O2含量急劇升高，5 d 達到最高的5.36 μmol/g，之后開始下降；MDA 含量呈上升趨勢，10 d 時比處理前增幅437.01%；SOD 酶活性呈先升后降趨勢，在3 d 時活性達到頂峰的188.0 U/g，相比對照，3-10 d 酶活性升高幅度為24.7%-66.1%；POD 酶活性整體呈上升趨勢，在10 d 時達到最高的3 819.88 U/g，相比對照，3 d 時活性提升幅度最大，為75.5%；CAT 酶活性前期變化不大，但在10 d 時酶活性明顯升高，達到276.91 nmol/（min·g），為對照（40.25 nmol/（min·g））的6.9 倍。

圖7 辣椒幼苗對高溫脅迫的生理生化響應Fig.7 Physiological and biochemical responses of pepper seedlings to high temperature stress

3 討論

近年來，隨著辣椒全基因組數據的公布［26-28］和生物信息學方法的不斷完善，研究人員已對辣椒DnaJ［29］、B-BOX［30］、MYB［31］、AP2/ERF［32］等多個基因家族進行了鑒定分析，但辣椒DNAJE基因家族系統鑒定和分析還未見報道。本研究基于Zunla 1全基因組數據，對辣椒DNAJE基因家族進行鑒定，從基因結構特征、系統進化、順式作用元件、共線性關系、組織特異性表達及高溫脅迫響應等多方面進行了分析和研究。

3.1 植物DNAJE基因功能分析

HSP70 是植物主要伴侶蛋白家族之一，在蛋白質量控制中起非常重要的作用。DnaJ 蛋白（HSP40）是HSP70 的共同伴侶，他能識別未折疊的底物并將其傳遞給HSP70，刺激ATP 酶活性，誘導伴侶構象改變，進而穩定其與底物的相互作用［33］。DNAJE 蛋白擁有類似于DnaJ 蛋白中參與結合底物的鋅指結構域［34］，而缺乏典型的J-結構域，能夠不依賴HSP70和J-結構域，直接與底物結合發揮作用。已有研究證實，ORANGE 蛋白作為DNAJE 蛋白家族一員，通過轉錄后調控植物烯合成酶PSY 以及通過抑制細胞核中轉錄因子TCP14 活性調控色素合成和葉綠體發育［35-37］。本研究在辣椒中鑒定出28 個DNAJE基因，進化分析顯示，辣椒、番茄和擬南芥DNAJE 蛋白被劃分至2 個亞族，每個亞族中辣椒、番茄和擬南芥成員分布情況相似，說明其具有較近的同源關系。啟動子順式作用元件對基因轉錄及調控具有非常重要的作用［38］。分析發現，DNAJE基因啟動子區域包含大量光響應、激素響應和脅迫應答元件。結果表明，DNAJE基因可能不僅參與光系統調控，也參與了激素響應和脅迫應答。諸多研究已經證實了這點，Amiya 等［13］報道了一個萊茵衣藻DNAJE 類囊體相關蛋白ZnJ6，其能與氧化還原酶、光合蛋白等相互作用，防止因外界環境脅迫使蛋白發生錯誤折疊和聚集，從而維持氧化還原和光合平衡，提升抗逆性。Hartings 等［39］在擬南芥中分離了HCF222基因，具有二硫化物還原酶活性，參與細胞色素b6f 組裝，進而影響PSII 和PSI 光合復合物的合成；Ham 等［40］通過對煙草（Nicotiana tabacum）DNAJE基因Tsip1的研究發現，其能夠與Tsi1轉錄因子互作，激活下游水楊酸反應基因，進而參與煙草抗逆脅迫應答反應。通過共線性分析發現，辣椒和擬南芥具有10 對直系同源基因，且CaDANJE1/AT4G10630、CaDNAJE8/AT5G61670、CaDNAJE10/AT4G13670、CaDNAJE11/AT1G75690、CaDNAJE13/AT5G58530 這5 對不僅進化關系最近，且序列相似度很高。其中，AT5G61670、AT4G13670 和AT1G75690 已分別被鑒定為擬南芥OR［41-42］、pTAC5［43］和LQY1［44］基因，在質體發育、逆境應答及光系統建成等方面發揮重要作用，因此推測辣椒近源基因也具有類似功能。

3.2 辣椒幼苗響應高溫脅迫相關基因表達分析

已有研究表明，熱激轉錄因子Hsf 和熱激蛋白HSP 是參與植物應激反應的主要通路［45］，CaHsfB5［46］、CaHSP22［47］和CaHSP16.4［48］等基因在辣椒響應高溫脅迫中顯著上調表達，進而提升辣椒耐熱性，這與本研究結果一致。DNAJE 蛋白與典型DanJ 蛋白具有相似的功能，其表達也能夠顯著提高植物對非生物脅迫的耐受力，從而降低細胞損傷［49］。Lee 等［50］在苜蓿（Medicago sativaL.）中鑒定了一個DNAJE基因MsDJLP，該基因的表達受低溫（4℃）和高溫（42℃）誘導，通過在煙草中異位過表達MsDJLP基因增強了轉基因煙草對低溫和高溫的耐受力。So 等［51］通過對大豆（Glycine maxL.）DNAJE基因GmDjp1的研究發現，其受多種非生物脅迫誘導，在大腸桿菌中異源表達GmDjp1基因，能夠提高大腸桿菌的耐受性，表明GmDjp1可能在細胞熱休克應激過程中發揮關鍵作用。本研究對NCBI SRA 數據庫中辣椒高溫脅迫轉錄組數據進行分析，從2 個亞族中挑選出12 個在高溫脅迫下表達量具有顯著差異的CaDNAJE基因進行RT-qPCR 分析，結果表明，CaDNAJE24在高溫脅迫中表達量降低，呈負調控，其他基因表達水平均顯著提高，但其在不同脅迫時間的表達量存在差異，這反映出DnaJ-Like基因以不同調控方式參與了植物響應高溫脅迫進程。

4 結論

在辣椒全基因組中共鑒定出28 個DNAJE家族基因，進化分析結果分為2 個亞族，同一亞族具有相似的蛋白保守基序、基因結構以及組織特異性表達模式。高溫脅迫導致辣椒生理生化改變，并誘導DNAJE基因高表達，表明該家族基因參與了辣椒響應非生物脅迫的生物過程。

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