核酸檢測假反應性獻血者歸隊可行性的研究

侯云 周寶琴 楊忠思

采供血機構一直在保證血液安全的前提下大力發展獻血者隊伍，探討假反應性獻血者歸隊策略是目前關注的熱點問題。采供血機構對酶聯免疫吸附試驗（簡稱酶免）呈反應性的獻血者歸隊研究及政策制定已較成熟，但是對核酸檢測反應性獻血者的歸隊策略還存在分歧。《反應性獻學者屏蔽與歸隊指南》針對核酸反應性獻血者歸隊策略內容為：（1）2013 版為核酸檢測結果必須是無反應性的，獻血者可進入歸隊流程。（2）2015 版調整為核酸三項聯檢結果反應性而鑒別試驗陰性，獻血者可進入歸隊流程。（3）2019 版調整為核酸檢測結果必須是無反應性的，即核酸三項聯檢反應性而鑒別試驗陰/ 陽性，獻血者都不進入歸隊流程。因此本文針對核酸歸隊策略調整的關鍵點，以綜述形式對核酸檢測反應性結果不一致情況進行分析，探討核酸檢測假反應性結果存在的可能，為采供血機構采取相應的確證和歸隊方案提供新的思路。

1 核酸反應性結果初檢/再檢不一致情況的研究

2015 年核酸檢測技術（nucleic acid testing，NAT）在血站全面開展，出現一定數量的酶免陰性核酸反應性的獻血者，但是這些獻血者的核酸反應性結果重復率偏低，即單人份檢測系統聯檢結果反應性會出現鑒別結果陰性；混樣系統初檢反應性池（pool），拆分結果為陰性。那么針對這些核酸反應性結果初檢/再檢不一致的情況，怎樣確證標本的真假陽性？該問題是目前采供血機構所面臨的共同挑戰，亟待解決。

1.1 核酸單人份系統和混樣系統判定反應性結果的對比研究

目前核酸檢測系統分為單人份系統和混樣系統。單人份系統是初檢為單個標本在一管內同時檢測乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）和 艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的核酸，當聯合檢測結果陰性時，則標本直接判定為陰性；而當聯合檢測有反應性時，則需要進行鑒別試驗，進而對該標本分別進行 HBV、HCV 和HIV 單項核酸檢測，以明確標本中是哪種病原體核酸陽性。在核酸單人份系統中，常出現聯合檢測HBV、HCV 和HIV 有反應性而鑒別試驗陰性的標本，也稱為核酸檢測不確定標本。該類標本在核酸單人份系統中占有較高的比例，據深圳市中心血站統計單項NAT 反應性標本的鑒別陽性率為24.76%，即檢測不確定標本率高達75.24%[1]。青島市中心血站2017—2020 年應用基立福核酸檢測系統檢測不確定標本率為59.14%。核酸單人份系統如此高的不確定標本率，說明有多數的標本是因為鑒別試驗陰性聯檢反應性而判定為不合格。這類標本無法確定究竟是哪種病原體核酸陽性或者是否由實驗的假陽性反應引起，其血液直接報廢，獻血者資格被屏蔽[2]。

混樣系統是多個標本混在一個pool 中檢測，如果初檢混樣pool 為反應性時，再進行多個標本的拆分檢測，如拆分有反應性標本即判定為該標本反應性；若拆分結果陰性，則所有標本判為陰性。在核酸混樣系統中，會出現初檢混樣pool 為反應性，拆分結果陰性。雖然混樣pool 中標本判定結果為陰性，但是無法確定真陰性的可能，會有漏檢的風險。青島市中心血站統計羅氏混樣系統上出現46.94%的初檢反應性pool，但拆分為陰性的現象，依據現行判定原則是血液合格，可以放行。但有數據顯示混檢陽性再拆分陰性的標本，感染 HBV 的風險高于合格獻血者組成的對照組，說明對混檢陽性再拆分陰性的標本中存在的風險要重視[3]。

1.2 核酸反應性結果初檢/再檢不一致的原因

核酸單人份系統和混樣系統，在初始檢測和再次檢測實驗中，一致的標本實驗者直接判定為NAT 反應性，血液報廢，獻血者永久屏蔽。而對于初始檢測反應性，再次檢測，無論鑒別實驗還是拆分實驗非反應性的，需要實驗者進行確證，其原因多為以下幾方面。

（1）隱匿性乙型肝炎病毒感染（occult HBV infection，OBI）的存在。OBI 是血液中乙肝表面抗原陰性而NAT 檢測陽性的HBV 感染特殊類型，當病毒濃度極低時（病毒顆粒在血漿中分布不均勻），可以完全檢出的概率較低，因此進行NAT 檢測時，相較于窗口期標本，隱匿性感染標本可能更容易漏檢。隨著NAT 的普及，越來越多的OBI 被檢出，國內許多地區獻血者都有較高的OBI 感染率，感染率接近1‰或更高[4-5]。廣東地區獻血者OBI 陽性率可達1.5‰[6]，因此每年淘汰的獻血者達上百人。青島市中心血站將部分基立福初檢反應性標本送臨檢中心進行 HBV 定量檢測， 聯檢反應性鑒別陰性的標本中18.5%可以被定量系統檢測出HBV 核酸的存在。因此核酸初檢/再檢不一致檢測結果可能是標本中存在低濃度的病毒。

（2）獻血時的NAT 檢測為假陽性。這種情況在核酸單人份系統較為多見。該系統只要初檢有反應性即判為不合格，往往假陽性較高，假陽性率可達21.6%[7]。廣州市中心血站對隨機抽選的391 例核酸反應性獻血者標本進行二次檢測，76.99%標本為非反應性；非反應性標本在羅氏進行再次確認，98.34%標本仍為陰性；由此推斷這部分標本在首次 NAT 聯檢時可能出現假反應。大連核酸檢測假陽性率占初次反應性標本 50.3%[8]。基立福系統數據表明酶免陰性核酸聯檢反應性的標本有24%～28%的假反應性標本。

2 核酸假反應性獻血者確證和歸隊方案的研究

2.1 核酸單人份檢測系統不確定標本的確證研究

（1）首選對該類標本可以進行2 次聯檢和1 次鑒別的實驗流程，≥1 次反應性結果判定為不合格。該流程操作簡單，可行性高，只需注意留取足量的標本。

（2）應用超高速離心技術，同時與靶向病毒基因區段符合的高敏感度巢式PCR 檢測相結合，對標本進行病毒核酸的確認。該方案技術復雜，要求配套設備多，多數需要公司配合完成。大連市血液中心應用兩流程對該類標本進行確認，并比較2 個流程的優劣，超離體系的 HBV 確認能力明顯好于推薦流程[9]。（3）實驗者可對該類獻血者進行追蹤，至少追蹤2 次，間隔6 個月，通過不同的核酸檢測系統進行確證，≥1 次反應性結果都判定為不合格；同時補充乙肝核心抗體（抗-HBc）或乙肝“2 對半”檢測，如抗-HBc 陽性，則可以初步判斷為OBI。安徽省血液中心完成28 名酶免陰性核酸陽性獻血者的2 次追蹤，所有隨訪標本分別在獻血后3 個月在浩源、基立福或羅氏系統在核酸檢測系統進行單人份核酸檢測，發現獻血者NAT 仍呈反應性的占75%，可以歸隊的獻血者只有1 例（占3.57%）[10]。雖然歸隊比例遠低于酶免單試劑反應性歸隊比例[11]，但是同時也說明核酸反應性獻血者存在假陽性的可能，且是核酸單人份系統的不確定標本。

2.2 核酸混樣系統初檢/再檢不一致標本確證研究。

（1）對于初次拆分非反應性的標本再進行2 次拆分后進行結果的判定，≥1 次反應性結果即判為不合格，非反應性結果則合格，這樣可以避免1 次拆分假陰性的漏檢。成都血液中心報道約在20 000 份標本中出現1 例混檢反應性初次拆分陰性，通過2 次拆分確認的 HBV DNA 反應性標本[12]。臨檢中心中也建議對初次拆分非反應性的標本進行2 次拆分后再予以放行的改進型策略[13]。

（2）對于初次拆分無反應性的標本，可以應用單人份系統對其進行聯檢判定，若為反應性結果再進行鑒別試驗；≥1 次反應性結果即判為不合格，非反應性結果則合格。青島市中心血站[14]抽取2019 年拆分檢測非反應性標本120份（20 個混樣pool），通過凍存留樣后進行聯合檢測全部為陰性；而2021 年抽取60 份（10 個混樣pool），混檢后平行進行基立福檢測，有2 個混樣pool 出現反應性標本。推測采血管中標本的儲存條件以及病毒載量低，是導致檢測結果重復性不佳的另一原因，確證檢測時需要重視和規避這些問題。

2.3 核酸假反應性獻血者歸隊方案的研究

由于不同國家或地區的輸血相關病毒流行率不同，采供血機構在保證血液安全的同時，采取不同的檢測策略和應對措施，以最大程度地減少對假反應性獻血者的屏蔽和淘汰。美國地區針對單人份檢測模式的NAT 反應性血液標本，無論該標本是重復反應性還是非重復反應性，都判定為不合格[15]。對于初次NAT 重復檢測結果不一致的獻血者，6 個月后再次進行 NAT 和酶免檢測，如果再檢結果均為陰性則該類獻血者可以歸隊。而澳大利亞等輸血相關病毒流行率較低的國家，采取的檢測策略是初次NAT 反應性標本再次復檢2 次，同時根據血清學（抗體等）試驗結果進行判斷；對于復檢陰性、血清學陰性的標本判定為合格，其血液運行放行，獻血者可以歸隊[16]。

中國屬于病毒性肝炎高發地區，實驗室檢測數據顯示60%的人口既往接觸過HBV， 其中HBV 慢性攜帶者占比約為7.2%[17]；而無償獻血人群中OBI 的流行率約為0.04%，明顯高于低HBV 流行率地區[18-19]。目前國內采供血機構對于單人份檢測系統只要初次聯檢反應性結果即予以報廢，獻血者屏蔽。該策略以最大程度降低輸血相關感染的風險，但卻忽略了假陽性的存在，損失了部分獻血者的權益；對于混樣系統反應性pool 中拆分1 次陰性即放行的策略，雖然符合試劑判定規則，卻低估了可能的漏檢風險。國內采供血機構可在保證臨床供血安全的前提下，對于血液的處置判定依據初篩檢測結果，但對于獻血者資格判定應考慮后續補充檢測的結果：（1）首選標本重復檢測（自身系統或是其他核酸系統），建議進行2 ～3 次的重復（最好取自血漿袋的標本）。（2）補充抗-HBc 或乙肝“2 對半”檢測，如抗-HBc 陽性則可以初步判斷為OBI。（3）對獻血者進行隨訪檢測，建議至少隨訪2 次以上，間隔3 個月。（4）補充血清學試驗和核酸定量分析，確定是窗口期感染、隱匿性感染、慢性感染、感染恢復期或假陽性，這樣可以給予獻血者較明確的結果解釋。

綜上所述，NAT 在血篩的應用能最大程度地降低輸血相關病毒感染的風險，但同時也增加了獻血人群陽性率的檢出。就意味著在國內無償獻血人群中有更多的人檢測結果異常，不適合獻血。對于這部分人，尤其是固定獻血的人群，他們除了接受這樣的結果以外，更有必要得到準確合理的解答。這就要求采供血機構對核酸檢測結果的真偽進行進一步的確證，在合適的條件下允許假反應性獻血者歸隊，避免血源的浪費。同時對于反應性的獻血者給予正確的指導建議，提高獻血者的回訪滿意度。另外，更重要的是將低水平病毒感染構成的潛在輸血風險降到最低，這也是采供血機構無償獻血事業自始而終的責任和義務。