MAGE-As蛋白及mRNA在肺癌中的表達水平變化及其臨床意義*

楊 晨，單長鳳

安徽理工大學第一附屬醫院病理科，安徽淮南 232007

全球肺癌發生率及病死率均位于惡性腫瘤的第1位，由于早期癥狀不具有典型性，肺癌的早期檢出率較低，多數患者確診時已處于中晚期，喪失最佳手術時機，5年生存率僅為4.7%～29.7%[1-3]。因此，尋找一種有效的早期標志物對肺癌臨床治療方案制訂及預后預測具有重要價值。黑色素瘤抗原(MAGE)屬分化良好的癌/睪丸抗原(CTL)家族，包含MAGE-Ⅰ類抗原與MAGE-Ⅱ類抗原，臨床研究已證實，MAGE-A3在Ⅰ期、Ⅱ期的非小細胞肺癌中的表達率為39.2%,MAGE-A4的表達率為48.0%[4-5]，在肺鱗癌中的表達率為98.0%[6]，而MAGE-As為MAGE-A家族成員，關于其在肺癌中的表達水平仍缺乏研究。為進一步探討MAGE-As蛋白及mRNA在肺癌組織中的表達模式及其預后中的價值，本研究對91例肺癌組織及其相應癌旁正常組織MAGE-As蛋白及mRNA進行檢測，并探討其與臨床病理特征及預后的關系，旨在為臨床提供指導?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取2018年7月至2020年12月于本院經手術病理組織檢查證實的91例肺癌患者作為研究對象，其中男59例，女32例，年齡45～69歲，平均(57.62±3.28)歲；病理類型：52例腺癌，31例鱗癌，8例混合癌；腫瘤最大徑：<5 cm 57例，≥5 cm 34例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期49例，Ⅲ～Ⅳ期42例；分化程度：高分化39例，中分化35例，低分化17例；淋巴血管間隙浸潤37例；淋巴結轉移35例；遠處轉移29例。本研究方案獲取本院醫學倫理委員會批準。所有研究對象均簽署知情同意書。納入標準：符合《中國原發性肺癌診療規范(2015年版)》中相關診斷標準[7]，且經手術病理組織學檢查證實為肺癌排除標準：(1)術前有放化療及內分泌治療史者；(3)合并肺心病、支氣管哮喘等其他肺部疾病者；(4)病變與鄰近結構分界不清晰者；(5)存在嚴重聽力障礙、語言功能障礙或精神性疾病者。

1.2方法 選取手術切除的肺癌組織及距離癌組織邊緣>5 cm的相應癌旁正常組織進行MAGE-As蛋白及mRNA檢測。(1)MAGE-As蛋白檢測：福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，脫水，染色，采用北京百奧萊博科技有限公司免疫組化SP法試劑盒檢測MAGE-As蛋白表達水平。陽性判定標準：高倍顯微鏡下發現細胞質或細胞核中存在棕黃色顆粒。按染色強度記為0分(無)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)；按染色范圍記為0分(高倍鏡視野中陽性細胞數<5%)、1分(5%≤高倍鏡視野中陽性細胞數<25%)、2分(25%≤高倍鏡視野中陽性細胞數<50%)、3分(50%≤高倍鏡視野中陽性細胞數<75%)、4分(高倍鏡視野中陽性細胞數≥25%)。二者乘積≥3分定義為陽性；(2)MAGE-As mRNA檢測：采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司TRIzol試劑提取肺癌組織及癌旁組織中總RNA，以北京普析通用儀器有限責任公司TU-1810S型紫外分光光度計測定RNA濃度。反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，實時熒光定量PCR擴增，擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，65 ℃ 45 s，72℃ 90 s，共31個循環，72 ℃ 6 min。瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳PCR產物。最后，以2-ΔΔCt公式計算MAGE-As mRNA相對表達量(單位為1)。第一輪PCR MAGE-1引物，F：5′-ACT GGC CCT GGC TGC AAC-3′；R：5′-GCC CTG ACC AGA GTC ATC AT-3′(擴增長度993 bp)；MAGE-1-1引物，F：5′-ACT GGC CTT GGC TGC AAC-3′；R：5′-CCC TGA CGA GAG TCA TCA TG-3′(擴增長度965 bp)。第二輪MAGE-2 PCR引物，F：5′-ACT GGC CCT GGC TGC AAC-3′；R:5′-AGG CCC TGG GCC TGG TG-3′(擴增長度914 bp)；MAGE-2-2引物，F：5′-ACT GGC CTT GGC TGC AAC-3′；R：5′-AGG CCC TGG GCT TGG TG-3′(擴增長度893 bp)。內參GAPDH引物，F:5′-ACC TGA CCT GCC GTC TAG AA-3′；R:5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。

2 結 果

2.1癌組織及癌旁正常組織MAGE-As蛋白陽性率及mRNA表達水平 肺癌組織MAGE-As蛋白陽性率及mRNA表達水平高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1～2。

表1 比較癌組織及癌旁正常組織MAGE-As蛋白及mRNA表達水平

圖1 MAGE-As蛋白在肺癌組織、癌旁正常組織中的表達免疫組化SP法圖

注：A為肺鱗癌的癌旁組織和腫瘤組織中MAGEA2的表達情況；B為肺腺癌的癌旁組織和腫瘤組織中MAGEA2的表達情況。圖2 MAGE-As mRNA在肺癌組織、癌旁正常組織中的表達

2.2不同臨床病理特征患者MAGE-As蛋白及mRNA表達水平 不同性別、年齡、體質量指數(BMI)、病理類型、腫瘤最大徑的患者MAGE-As蛋白及mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同臨床分期、分化程度、有無淋巴血管間隙浸潤、淋巴結轉移、遠處轉移的患者MAGE-As蛋白及mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 比較不同臨床病理特征患者MAGE-As蛋白及mRNA表達水平

2.3MAGE-As蛋白及mRNA表達水平與臨床病理特征相關性 經Spearman相關性分析可知，MAGE-As蛋白及mRNA表達水平與淋巴結轉移、臨床分期、遠處轉移均呈正相關(P<0.05)，與分化程度呈負相關(P<0.05)，見表3。

表3 MAGE-As蛋白及mRNA表達水平與臨床病理特征相關性

2.4MAGE-As蛋白及mRNA表達水平與肺癌預后的關系 91例肺癌患者脫落5例，3年生存率66.30%(57/86)，以表1中MAGE-As蛋白及mRNA表達水平均值為界限，將患者分為MAGE-As蛋白陽性表達、陰性表達，MAGE-As mRNA高表達者(>2.86)、低表達者(≤2.86)，結果顯示，MAGE-As蛋白陽性表達、MAGE-As mRNA高表達者3年生存率低于MAGE-As蛋白陰性表達、MAGE-As mRNA低表達者(χ2=8.195、31.389，P<0.05)，見圖3～4。

圖3 MAGE-As蛋白與肺癌3年預后的關系

圖4 MAGE-As mRNA表達與肺癌3年預后的關系

2.5肺癌預后的影響因素 以3年肺癌預后為因變量(生存=0，死亡=1)，以年齡、臨床分期、分化程度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結轉移、遠處轉移、MAGE-As蛋白及mRNA為自變量，應用Cox多因素回歸方程分析，結果顯示，臨床分期、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、MAGE-As蛋白及mRNA是肺癌預后的重要影響因素(P<0.05)，見表4。

表4 肺癌預后的Cox多因素回歸分析

3 討 論

既往研究指出，選擇合適的靶抗原是腫瘤免疫治療開展的關鍵[8]。MAGE-As通過腫瘤特異性表達水平模式，可被CTL細胞識別，促使機體產生特異性免疫應答，故具有成為腫瘤免疫治療靶點的潛力[9-10]。LI等[11]通過收集115例乳腺癌組織顯示，MAGE-As共抗原肽特異性CTL與抗CTLA-4單克隆抗體和5DC聯合使用，具有有效腫瘤細胞殺傷作用，可為乳腺癌治療發展提供了新的理論。本研究中，MAGE-As蛋白在肺癌組織中呈高表達，而在癌旁正常組織中無表達，結合朱呈祥等[12]和李青等[13]研究考慮機制可能與腫瘤組織中表觀遺傳學調節過程紊亂有關。誘導腫瘤中AMP依賴的蛋白激酶泛素化可能也是MAGE-As蛋白參與肺癌病理進程的重要機制。提示MAGE-As蛋白有望成為理想的腫瘤免疫治療靶點，并可作為腫瘤標志物檢測肺癌的發生。同時，越來越多文獻報道，MAGE基因在肺癌早期腫瘤形成、細胞增殖和侵襲調控中發揮了重要作用[14-15]。本研究經Spearman相關性表明，MAGE-As蛋白的表達與肺癌患者臨床病理特征有關，這可能歸因于MAGE-As可誘導腫瘤細胞中上皮間質轉化，繼而對腫瘤細胞侵襲及轉移能力產生一定影響。因此推測MAGE-As蛋白的表達水平可能與肺癌惡性程度相關，但谷麗娜等[16]研究卻認為，肺腺癌組織中MAGE-As蛋白表達與臨床分期、淋巴結轉移均無相關性，與本研究觀點存在一定差異，可能與樣本量、肺癌類型不同有關。進一步經Log-Rank檢驗發現，MAGE-As蛋白陽性表達可能降低肺癌3年生存率，推測MAGE-As蛋白可作為肺癌患者預后的有效預測指標。

另外，多項研究發現，循環腫瘤細胞在腫瘤發生、發展、疾病進展及預后評估中扮演著重要角色，但其具有異質性、聚集成團等缺點，在循環血中含量較低[17-18]。而miRNA是一種非編碼小分子RNA，可在基因轉錄后調控蛋白質的生物合成，參與細胞增殖、分化、凋亡、侵襲、信號轉導等進程，且miRNA分子穩定，樣本獲取較為方便，適用于臨床實驗室檢測[19-20]。有研究表明，MAGE-As可能作為循環腫瘤細胞的標記，有效評估腫瘤負荷情況，對患者臨床轉歸具有重要預測價值[21]。本研究通過對比發現，肺癌組織MAGE-As mRNA表達水平高于癌旁正常組織，與高建全等[22]研究相似，并與淋巴結轉移、臨床分期、遠處轉移呈正相關，與分化程度呈負相關，這可能肺癌發生時，MAGE-As基因啟動子區出現異常去甲基化現象，導致MAGE-As表達水平明顯升高，增加基因不穩定因素，提高腫瘤易感性，從而參與肺癌病理進程。由此可見，檢測MAGE-As mRNA表達對肺癌早期發現、惡性程度評估及臨床靶向治療均起到了一定指導價值。Cox多因素回歸分析進一步提示MAGE-As mRNA高表達水平是肺癌預后的獨立危險因素，說明MAGE-As mRNA低表達水平有助于指導肺癌患者獲得較好預后。

綜上所述，MAGE-As蛋白陽性表達及mRNA高表達水平可能與肺癌發生、發展相關，可為臨床評估肺癌病理特征、促進預后改善提供指導。但本研究不足之處在于納入病例數較少，缺少在免疫治療時MAGE-As蛋白及mRNA表達情況是否可用于指導臨床實踐用藥研究，有待后續進行多中心、大樣本研究。