腦出血患者血清中miR-331-3p和NLRP6表達水平與患者疾病嚴重程度及神經損傷的關系

杜江峰,吳 瑤,向 祥,汪 峰,張鈴鐺,李 驥

重慶大學附屬三峽醫院神經外科，重慶 404000

腦出血是常見多發的神經系統腦血管疾病，也是發病率、致殘率和死亡率高的中風亞型，占全球所有中風的10%～20%，30 d內死亡率在30%～50%，即使是幸存者也經常會導致腦損傷和嚴重的神經功能障礙，給家庭和社會帶來沉重的負擔[1-2]。因此，了解腦出血誘導的腦損傷和神經損傷的潛在機制有利于減輕腦損傷并改善腦出血后的神經功能恢復。目前，研究證實了腦出血后的炎癥反應參與了腦損傷[3]。微小RNA(miRNA)是一種小型、非編碼的調節性RNA，與目標mRNA配對可抑制mRNA的翻譯過程，或導致mRNA的降解，且在血清中穩定存在，在疾病的診斷和治療中發揮重要作用。miR-331-3p是miR-331家族成員之一，對其的研究主要專注于癌癥中，最近幾年的研究發現，miR-331-3p在病理生理變化中異常表達，與炎癥反應相關，具有潛在的神經保護作用[4]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族(NLRs)是一種主要的先天免疫傳感器，調節炎癥反應信號通路，近年來關于NLR在神經損傷方面的研究越來越多[5]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白6(NLRP6)是NLR家族的一員，參與炎癥性疾病和宿主防御機制，其表達在許多生理和病理過程中受到嚴格調控[6]。在小鼠中的研究表明，miR-331-3p和NLRP6在腦出血的炎癥反應中具有重要作用，但其在腦出血患者血清中的表達水平及與患者病情嚴重程度及神經損傷的關系目前尚未被研究[7]。因此，本研究檢測腦出血患者血清中miR-331-3p和NLRP6的表達水平，初步探討了其表達水平與病情嚴重程度及神經損傷的關系，旨在為臨床制訂新的治療措施提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取2016年5月至2018年5月于本院神經外科診治的92例腦出血患者作為觀察組，其中男50例，女42例，年齡25～75歲，平均(50.26±11.56)歲。同時，選取同期體檢的92例體檢健康者為對照組，其中男44例，女48例，年齡30～78歲，平均(51.76±12.09)歲。納入標準：(1)所有患者在發病后24 h內入院治療，經顱腦CT檢查確認出現出血灶；(2)符合《中國腦血管病防治指南》[8]中的診斷標準；(3)臨床資料齊全。排除標準：(1)含潛在血管病變、凝血功能受損和腫瘤出血的患者；(2)近1個月內發生感染的患者；(3)頭部外傷造成出血的患者；(4)合并其他神經系統疾病的患者。本研究取得了本院倫理委員會的批準，并獲得了對照組和患者本人及親屬的書面知情同意。

1.2方法

1.2.1標本采集與保存 采集觀察組和對照組清晨空腹狀態下的靜脈血5 mL，在4 ℃條件下3 000×g離心10 min后，從血液中分離出血清后分裝到無菌的離心管內，在-80 ℃保存至測定。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測miR-331-3p和NLRP6的表達水平 根據試劑盒的說明書，使用TRIzol(貨號：10296028，購于賽默飛世爾科技有限公司)從觀察組和對照組的血清中提取總RNA。然后取0.5～1.0 μL的RNA使用PrimeScriptM RT Reagent Kit(貨號：RR037A，購于日本TaKaRa公司)根據試劑盒說明書進行反轉錄反應，獲得cDNA保存于-20 ℃備用。以cDNA為模板，使用TB Green?Premix Ex Taq Ⅱ Kit(貨號：RR820A，購于購于日本TaKaRa公司)在ABI7500熒光定量系統上進行實時RT-PCR分析。定量引物使用Primer5.0軟件設計，分別以U6和GAPDH作miR-331-3p和NLRP6的內參基因，引物序列見表1，引物干粉由上海生工生物公司合成。采用2-ΔΔct法分析各組表達水平，計算步驟為：(1)計算對照組6個復孔的miR-331-3p或NLRP6 ct的平均值，ct miR-331-3p或NLRP6對照組=ct對照組-miR-331-3p或NLRP6 ct的平均值，ct miR-331-3p或NLRP6觀察組=ct觀察組-miR-331-3p或NLRP6 ct的平均值；(2)同樣的方法計算出ct內參對照組和ct內參觀察組；(3)計算ct miR-331-3p或NLRP6對照組=ct miR-331-3p或NLRP6對照組-ct內參對照組，ct miR-331-3p或NLRP6觀察組=ct miR-331-3p或NLRP6觀察組-ct內參觀察組；(4)計算2-ΔΔct，即各組miR-331-3p或NLRP6的相對表達水平。

表1 RT-RCR引物序列

1.2.3腦出血嚴重程度及神經損傷程度評定 根據入院時頭顱CT檢測結果，采用多田氏公式(ABC/2)法計算血腫體積評估病情嚴重程度，A：最大出血層面血腫的最長徑，B：最大出血層面血腫的寬，C：血腫層面之間的厚度。患者可分為大血腫組(>25 mL)，中血腫(11～25 mL)，小血腫組(<11 mL)。根據美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分評定腦出血患者的神經功能受損程度，包括意識清醒程度和肌力等級等項目。NIHSS評分總分為42分，患者可分為輕型患者組(1～4分)，中型患者組(>4～15分)，重型患者組(>15分)[9]。

2 結 果

2.1兩組血清miR-331-3p和NLRP6表達水平的差異 RT-PCR結果顯示，觀察組中miR-331-3p表達水平與對照組相比降低，而觀察組中NLRP6表達水平與對照組相比升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組血清miR-331-3p和NLRP6表達水平的差異

2.2不同血腫體積患者中血清miR-331-3p和NLRP6表達水平的差異 根據血腫體積大小將92例患者劃分為21例大血腫組，33例中血腫組和38組小血腫組。結果如表3所示，miR-331-3p表達水平在大血腫組患者血清中低于中、小血腫組，在中血腫組患者血清中低于小血腫組，差異有統計學意義(P<0.05)，NLRP6表達水平在大血腫組患者血清中高于中、小血腫組，在中血腫組患者血清中高于小血腫組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 不同血腫體積患者中血清miR-331-3p和NLRP6表達水平的差異

2.3不同神經損傷患者中血清miR-331-3p和NLRP6表達水平的差異 根據NIHSS評分將92例患者劃分為33例輕型患者組、40例中型患者組和19例重型患者組。結果如表4所示，miR-331-3p表達水平在重型患者組血清中低于輕、中型患者組，在中型患者組血清中低于輕型患者組，差異有統計學意義(P<0.05)，NLRP6表達水平在重型患者組血清中高于輕、中型患者組，在中型患者組血清中高于輕型患者組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 不同神經損傷患者中血清miR-331-3p和NLRP6表達水平的差異

2.4觀察組患者血清miR-331-3p、NLRP6表達水平與血腫體積和NIHSS評分的相關性 Pearson相關性分析結果顯示，腦出血患者的血清miR-331-3p表達水平與血腫體積和NIHSS評分呈負相關(r=-0.539，P<0.05；r=-0.597，P<0.05)，血清NLRP6表達水平與血腫體積和NIHSS評分呈正相關(r=0.738，P<0.05；r=0.705，P<0.05)，見圖1。

注：A為血清miR-331-3p與NLRP6評分的相關性；B為血清miR-331-3p對血腫體積的相關性；C為血清NLRP6與HIHSS評分的相關性；D為血清NLRP6與血腫體積的相關性。圖1 觀察組患者血清miR-331-3p、NLRP6表達水平與血腫體積和NIHSS評分的相關性分析

2.5觀察組患者血清miR-331-3p與NLRP6表達水平的相關性 Pearson相關性分析結果腦出血患者血清中miR-331-3p表達水平與NLRP6表達水平呈負相關(r=-0.483，P<0.05)，見圖2。

圖2 觀察組患者血清miR-331-3p與NLRP6表達水平的相關性分析

3 討 論

隨著人口的老齡化，腦出血的發病率也在逐漸升高，是社會上面臨的重大的公共健康問題[1]。腦出血后的水腫、炎癥反應等共同引起繼發性腦損傷，細胞凋亡，最終導致神經功能受損，而目前對于腦出血這一疾病的臨床治療方式仍沒有突破性進展[9-10]。從分子角度探索腦出血引起的神經炎癥損傷的機制，能夠為尋找臨床治療腦出血后遺癥的有效靶點提供理論依據。

miRNAs對腦出血的影響是近年來的研究熱點，大量結果證實了miRNAs廣泛參與腦出血后的病理生理機制，在腦出血后繼發性腦損傷的發生過程中發揮積極或消極的作用。例如，miR-223在腦出血疾病中通過下調NLRP3，抑制炎癥反應，從而改善神經功能[11]。miR-331-3p是miR-331家族的一員，位于12q22n染色體上，越來越多的研究報道，miR-331-3p在疾病中發揮重要作用。朱金源等[12]在急性肺損傷中發現miR-331-3p表達水平下降，并且可通過調控CCR1的表達水平參與該疾病的發生發展過程。LIU等[4]在阿爾茨海默病患者的血清中發現miR-331-3p表達降低，并與患者的簡易精神狀態檢查量表評分和促炎細胞因子水平相關，提示miR-331-3p具有潛在的神經保護作用。NIE等[7]在小鼠中的實驗結果首次提示，miR-331-3p可能在腦出血后的炎癥反應中發揮作用。本研究在腦出血患者的血清中同樣發現miR-331-3p的表達水平下降，說明血清miR-331-3p的表達水平在腦出血的發生過程中具有重要作用。血腫體積和NIHSS評分與患者的病情和神經功能密切相關，本研究結果顯示，血清miR-331-3p在不同血腫體積的患者和不同NIHSS評分的患者中的表達水平存在差異，大血腫患者miR-331-3p表達水平低于中、小血腫患者，重型患者miR-331-3p表達水平低于中、輕型患者，進一步分析顯示血清miR-331-3p表達水平與腦出血患者的血腫體積和NIHSS評分呈負相關，表明血清miR-331-3p的水平與腦出血的嚴重程度和神經損傷程度之間存在密切關聯。

NLRP6是報道的第一個能抑制先天免疫反應的NLRP家族成員，之前有研究證實其在腦缺血/再灌注損傷后表達上調，具有炎癥小體依賴性促炎作用，可作為炎癥性疾病潛在的治療靶點[13]。XIAO等[14]發現NLRP6炎性小體可能通過激活小膠質細胞IL-1β和IL-18參與腦出血后的炎癥反應，敲低NLRP6可減輕腦出血后的腦損傷、緩解炎癥并抑制自噬。NLRP6的研究大都集中在動物實驗中，本研究檢測了腦出血患者的血清中NLRP6的表達水平，與對照組相比表達水平增加，說明NLRP6表達水平與腦出血的發生有關。不同血腫體積的患者和不同NIHSS評分的患者中NLRP6的表達水平存在差異，大血腫患者NLRP6表達水平高于中、小血腫患者，重型患者NLRP6表達水平高于中、輕型患者，且血清NLRP6表達水平與腦出血患者的血腫體積和NIHSS評分呈正相關，表明NLRP6在腦出血后的腦損傷和神經功能障礙中具有重要作用，可能參與腦損傷和神經功能障礙發生過程。

miR-331-3p涉及多個神經生物學過程的信號通路，并且此前的研究提出miR-331-3p下調可增加NLRP6表達水平，減輕炎癥反應，促進腦出血后小鼠神經功能恢復[7,15]。本研究分析結果與之相似，腦出血患者血清中miR-331-3p與NLRP6表達水平呈負相關，說明兩者共同影響了腦出血患者的病情和神經受損程度，可作為臨床改善腦出血后損傷的潛在治療靶點。

綜上所述，腦出血患者血清中miR-331-3p表達水平降低，NLRP6表達水平升高，隨著病情和神經受損程度的加重，miR-331-3p表達水平逐漸降低，NLRP6表達水平逐漸升高，兩者表達水平與腦出血患者的病情嚴重程度和神經受損程度相關，共同參與腦出血的發展過程，可能作為腦出血臨床治療的靶點。