高尿酸通過下調UCP2表達水平引起線粒體損傷的研究*

趙建越，孫 宇，顧李霖，王會中

中國人民解放軍第三〇五醫院檢驗科,北京 100017

高尿酸血癥是臨床上一種常見的疾病，高尿酸一旦形成晶體并沉積就會誘發局部炎癥反應和組織破壞，即形成痛風。高尿酸血癥的形成原因比較復雜，且患病率呈逐年增加并出現年輕化的趨勢[1-2]。目前有研究表明，高尿酸血癥和痛風是慢性腎病、高血壓、心腦血管疾病及糖尿病等疾病的獨立危險因素，是引起死亡的獨立預測因子[3-4]，因此高尿酸血癥逐漸引起相關學科的高度重視。尿酸是一種關鍵性的促炎因子，隨著尿酸濃度的增高其能夠抑制細胞增殖、衰老甚至凋亡，尿酸還能夠對線粒體DNA和三磷酸腺苷(ATP)合成造成影響[5-7]。線粒體是細胞中的重要細胞器之一，是細胞內最重要的生物能量轉化裝置，在線粒體內依靠電子傳遞和質子漏來控制ATP的產生。線粒體解偶聯蛋白2(UCP2)作為解偶聯蛋白家族中重要成員是線粒體內重要的跨膜蛋白，且與質子調控高度關聯，是線粒體內電化學梯度的重要調節蛋白，研究表明UCP2能調節線粒體損傷指標活性氧(ROS)的生成，調控ATP的合成和線粒體膜電位差等來調節機體的氧化應激能力[8-9]。尿酸特別是高尿酸作為一種促氧劑能夠對細胞以及線粒體造成損傷[10]，但目前高尿酸對線粒體UCP2及其相關指標的影響研究較少，尿酸對線粒體損傷的生理功能還尚未清晰，尿酸對線粒體內環境以及線粒體內能量轉化等的影響問題還尚待解決，因此還有許多基礎工作要做。本文則在細胞水平上分析了高尿酸對細胞線粒體損傷，分析了UCP2表達水平變化及尿酸對UCP2相關指標ROS、線粒體膜電位、ATP合成的影響，初步探討高尿酸對細胞線粒體損傷的可能機制，為深入研究尿酸對線粒體損傷原理提供相關支持，并通過這些分析為高尿酸血癥的臨床控制和治療提供可能的作用靶點。

1 材料與方法

1.1材料 實驗采用HL7702細胞，為健康者肝源細胞，購自上海富衡生物有限公司。

1.2儀器與試劑 噻唑藍(MTT)、尿酸試劑由sigma公司生產并根據使用說明書進行所需濃度配制；細胞培養基RPMI1640由HyClone (SH30809.01)公司生產；胎牛血清由美國GIBCO(10270-106)公司生產；總RNA提取試劑盒購自上海羽朵生物科技有限公司(00266)；所需引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成； FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒從天根生化科技(北京)有限公司購買(KR118-02)；Real-time PCR試劑盒從北京全式金生物有限公司購買(AQ131-01)；Western blot蛋白裂解液從上海碧云天生物技術有限公司購買(P0013)；UCP2一抗從Proteintech Group公司購買(11081-1-AP)；GAPDH一抗(BM1623)、二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(A0208)，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216))從上海碧云天生物技術有限公司購買；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)從索萊寶科技有限公司購買(中國，M8650)；ROS檢測熒光探針-DHE(二氫乙錠)從江蘇凱基生物技術有限公司購買(KGAF019)；ATP水平檢測試劑盒從北京索萊寶科技有限公司購買(BC0305)，所有試劑均在效期內。 ABI7500實時熒光定量PCR(Q-PCR)儀(ThermoFisher,美國)；酶標儀(Thermo，型號：MULTISKAN FC，美國)；生物熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS(IX71)，德國)；所有儀器均經過校準。

1.3方法

1.3.1細胞培養 HL7702細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養基培養，在恒溫培養箱中以5% CO2、37 ℃以及飽和濕度條件下松蓋培養，每1～2 d換液1次，當細胞長至鋪滿80%培養瓶時再消化傳代。

1.3.2MTT實驗篩選尿酸作用時間 實驗分為3組，分別培養24、48、72 h，每組依據參考文獻加入終濃度分別為400、800、1 200 μmol/L的尿酸作用細胞，對照組加等量的生理鹽水，對不同時間分組細胞加入100 μL 10% MTT反應液，酶標儀測定在595 nm處的吸光度，分析細胞活性確定培養時間。

1.3.3Q-PCR法比較UCP2的mRNA表達水平 采用TRIZOL法提取細胞總RNA，用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒，反轉錄為cDNA，采用20 μL Q-PCR反應體系[引物各0.4 μL，2×supermix(預混液)10 μL，PASSIVE DYE(參比染料) 0.4 μL,模板 2 μL，水 6.8 μL]，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參，比較HL7702細胞UCP2的mRNA表達差異，引物見表1。內參及UCP2引物大小均為20 bp。

表1 UCP2和內參GAPDH的引物序列(5′-3′)

1.3.4Western blot檢測HL7702細胞UCP2水平 離心收集細胞，每份樣品加150 μL裂解液，于冰上裂解45 min，并輕搖細胞促進細胞充分裂解，4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，并測定蛋白質濃度。分別取100 μg不同尿酸濃度處理的細胞總蛋白，用SDS-PAGE電泳分離，然后轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，于5%脫脂奶粉的封閉液(TBST)封閉2 h，再用UCP2和GAPDH一抗4 ℃過夜，洗去多余一抗，二抗37 ℃ 2 h，洗去多余二抗，電化學發光(ECL)法顯色分析結果。

1.3.5免疫熒光法檢測ROS生成 以二甲基亞砜(DMSO)溶解DHE為 5 mmol/L 的溶液，去除細胞培養液，每孔加入1 mL稀釋好的DHE，37 ℃細胞培養箱內孵育20～30 min，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DHE，孵育結束后，用新鮮培養液清洗細胞，熒光顯微鏡進行熒光拍照，通過熒光強度對ROS生成量進行評估。

1.3.6JC-1熒光探針法檢測線粒體膜電位 按要求配置好染色工作液，細胞中加入 1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻，細胞培養箱中37 ℃孵育20 min，孵育結束后，吸除上清，用 JC-1 染色緩沖液(1×)洗滌2次，加入2 mL細胞培養液，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7ATP水平檢測 按試劑盒要求進行ATP的提取，酶標儀在波長為340 nm測定吸光度，根據試劑盒參考共識進行ATP水平的數據測算。

2 結 果

2.1MTT法篩選尿酸作用細胞時間 從圖1可見細胞培養72 h后不同濃度尿酸的MTT吸光度值比較，差異有統計學意義(P<0.05)，因此選取72 h作為后續實驗時間。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。圖1 MTT實驗篩選結果圖

2.2細胞UCP2的mRNA轉錄水平以及UCP2蛋白表達水平數據分析 不同濃度尿酸處理后UCP2 mRNA轉錄表達水平差異有統計學意義(圖2)，3個濃度組(400、800、1 200 μmol/L)細胞的UCP2mRNA轉錄水平與對照組相比均呈現出明顯下降趨勢，分別占對照組的46.30%、16.40%和5.00%。同時，UCP2蛋白表達分析發現(圖3)，UCP2的蛋白表達與對照組相比均呈現出明顯下降趨勢，且隨著尿酸濃度的增加呈逐漸遞減趨勢。

注：**表示P<0.01。圖2 不同濃度尿酸處理的細胞培養72 h后，線粒體UCP2的mRNA轉錄水平

圖3 不同濃度尿酸處理的細胞培養72 h后，線粒體UCP2的蛋白表達結果

2.3細胞線粒體ROS生成量的分析 與對照組相比,3個濃度組(400、800、1 200 μmol/L)的ROS熒光強度分別為對照組的133倍、184倍和253倍(圖4、圖5)，細胞線粒體中ROS的生成量呈逐漸升高狀態。

注：熒光越強說明ROS生成量越大，**表示P<0.01。圖4 不同濃度尿酸處理的細胞培養72 h后，細胞ROS熒光強度量化分析圖

注：隨著尿酸濃度增加熒光強度越強，ROS生成量越多。圖5 不同濃度尿酸處理的細胞培養72 h后，細胞ROS熒光顯示圖

2.4細胞線粒體膜電位的變化分析 與對照組相比，3個濃度組(400、800、1 200 μmol/L)線粒體膜電位分別為對照組的14.53%、8.30%和4.70% (圖6、圖7)，細胞線粒體中線粒體膜電位呈逐漸降低趨勢，說明高尿酸對線粒體UCP2抑制作用會造成線粒體膜電位的降低，即降低線粒體基質與內膜間的電位差。

注：**表示P<0.01。圖6 不同濃度尿酸處理的細胞培養72 h后，尿酸對細胞線粒體膜電位的影響變化圖

注：隨著尿酸濃度增加綠色熒光強度越強,線粒體膜電位越低。圖7不同濃度尿酸處理的細胞培養72 h后，細胞綠色熒光示意圖

2.5ATP水平檢測分析 與對照組相比，3個濃度組(400、800、1 200 μmol/L)ATP合成率為對照組的83.45%、69.92%和55.64%，隨著尿酸的濃度增加而ATP水平逐漸減少。見圖8。

注：**表示P<0.01。圖8不同濃度尿酸處理的細胞培養72 h后，ATP水平變化圖

3 討 論

近年來高尿酸血癥發病率逐年升高，尿酸的高低與否已經成為備受重視的一項指標，而隨著尿酸濃度的逐漸升高細胞內特別是線粒體內則發生著氧化應激和慢性炎癥等一系列的反應[6]。氧化應激是細胞氧化系統和抗氧化系統之間的不平衡，是氧化自由基和ROS過度產生的結果[10-11]。而高尿酸作為一種促氧化劑在多個細胞和動物模型中被證實能夠引起局部炎癥和氧化應激，能夠造成ROS的增加并抑制細胞增殖和影響細胞形態甚至是促進細胞走向凋亡[10,12]。線粒體內膜蛋白UCP2是UCP家族中的重要一員，它與電子傳遞中的質子泄露相關聯，能夠通過調控質子泄露來影響細胞氧化應激反應，并影響電子傳遞鏈的過程中的ROS的生成、線粒體膜電位的變化和ATP的合成[8,13-14]。而在目前的研究中發現，UCP2蛋白表達水平與多種疾病相關如肥胖、糖尿病、心臟疾病和高血壓等，并在這些疾病中起到調節氧化應激壓力的作用[15-18]。有研究發現UCP2能夠降低ROS的產生起到保護細胞的作用[11,17-18]，如一些關于慢性高糖的相關研究中就證實UCP2是能夠降低ROS的產生，這可能是由于葡萄糖為細胞所必需的營養物質，葡萄糖會促進細胞增殖從而導致UCP2過表達。但這些研究都是以糖類和脂類代謝為基礎進行研究，并未將尿酸作為一個獨立因素進行研究。特別是在近年來高尿酸血癥越來越年輕化的趨勢下，將尿酸特別是高尿酸作為一個影響身體健康的指標來研究具有一定的指導意義，因此研究尿酸對體內細胞的損傷機制將成為一個重要課題。

線粒體UCP2是細胞內與能量代謝相關的重要蛋白，是控制線粒體膜間隙與基質之間電勢的關鍵性蛋白，因此研究尿酸對UCP2的影響將關系著整個細胞的能量代謝和生命活動。本研究發現經過不同濃度尿酸處理72 h后，細胞中線粒體UCP2蛋白表達呈明顯降低趨勢；線粒體UCP2的mRNA轉錄水平分別為對照組的46.30%、16.40%和5.00%，這說明尿濃度越高對線粒體UCP2的表達抑制越強。而且本研究發現經過不同濃度尿酸處理72 h后線粒體膜電位分別為對照組的14.53%、8.30%和4.70%；ATP合成率分別為對照組的83.45%、69.92%和55.64%。由于線粒體UCP2表達減少則會造成線粒體膜間隙與基質之間質子梯度變小，結果會降低線粒體內膜內外的電勢，而膜電位的降低則會造成ATP合成的減少，而且從結果中不難發現尿酸濃度越高則對線粒體UCP2的影響就越大，對線粒體UCP2影響越大則線粒體膜電位和ATP合成率就越低,可見尿酸的濃度與線粒體UCP2表達、膜電位和ATP合成呈負相關，且上述結果說明尿酸特別是濃度越高的尿酸對線粒體UCP2的影響越大，對線粒體的損傷就越大。在另一項線粒體UCP2的相關評估指標ROS中，則是隨著尿酸濃度增加，3個濃度尿酸處理細胞的ROS熒光強度分別為對照組的133、184和253倍，呈逐漸升高的趨勢，這說明隨著尿酸濃度的逐漸升高，尿酸抑制了UCP2的生成進而導致細胞產生大量的ROS，而不是起到促進UCP2過表達降低ROS的作用，這與高糖高脂等可能促進UCP2過表達而降低ROS的研究產生了不一致的結果，而且隨著尿酸濃度的升高ROS生成就越多，對線粒體損傷性就越大，這說明高尿酸對細胞的損傷可能是一種不可逆性的損傷。從上面的實驗結果以及結合其他研究成果，可以得到以下結論：高尿酸對線粒體UCP2的表達可能存在著抑制作用，高尿酸對細胞的損傷作用可能的機制之一就是高尿酸對線粒體UCP2的損傷，進而造成膜電位的降低、ATP合成的減少以及ROS的大量產生并最終引起線粒體和細胞的損傷。如果能夠切斷或者減少高尿酸對UCP2的表達抑制就可能會對高尿酸血癥的治療起到更好的協同作用。但本實驗主要是在細胞水平上進行初步的分析，還缺少動物實驗方面的數據來支持，在下一步的實驗中將更加細致的分析高尿酸在動物體內對線粒體UCP2的影響，分析高尿酸對線粒體以及線粒體內微生態的損傷機制。

綜上所述，本文著重研究了尿酸在不同濃度情況下對線粒體UCP2蛋白表達的影響，初步闡述了高尿酸對線粒體UCP2相關聯的ROS的生成、線粒體膜電位的變化和ATP的合成在不同濃度下的影響程度，初步驗證了高尿酸對細胞損傷的可能的機制之一即對細胞線粒體UCP2蛋白表達的抑制作用，并為進一步研究高尿酸對細胞中線粒體損傷機制提供了理論支持。本研究還發現隨著尿酸濃度的增高，尿酸對細胞的危害就越大，這就提示人體內也可能存在著類似情況，而且長時間的高尿酸不被重視后還可能和高血壓、高血糖、高血脂、心肌炎、動脈粥樣硬化等相關疾病相互作用。因此，高尿酸必須要引起重視，特別是一些年輕患者，早發現、早控制、早治療是應對高尿酸的最正確的選擇。