皮膚性病門診患者HPV基因型分布特征研究*

李春花，王有為，羅才會，李雪茹，田詠梅

電子科技大學附屬醫院/四川省人民醫院臨床醫學檢驗中心，四川成都 610072

人乳頭瘤病毒(HPV)是尖銳濕疣的病原體，尖銳濕疣是以生殖器部位皮膚黏膜的良性增生性損傷為主的一種性傳播疾病，其復發率及傳染性強，居國內性傳播疾病的第二位[1]。高危型HPV感染與陰莖癌[2-3]、宮頸癌[4-6]、口咽鱗狀細胞癌[7-8]等發病密切相關。因此HPV的檢測，特別是HPV-DNA分型檢測對疾病的預防、早期發現與治療有重要意義[9-11]。據文獻報道，HPV亞型的分布因地區不同而有所區別，感染與致病力因亞型的不同而有所差異[12-15]。為了解成都地區HPV的流行特征，比較四價與九價HPV疫苗對其覆蓋率的差異,本研究對2018年1月至2019年6月于本院皮膚性病門診就診患者的HPV感染情況進行分析，并進一步研究了HPV21型基因分型特征，為HPV相關疾病的防治提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年6月于本院皮膚性病門診進行HPV檢測且未接種過HPV疫苗,近3個月內未接受系統或局部免疫治療，未局部使用抗病毒藥物治療的16～80歲初診患者3 303例，平均年齡33.7歲。所有患者均自愿進行HPV基因型別檢測，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 HPV分型檢測試劑盒(廣東凱普生物科技有限公司)、實時熒光定量PCR擴增儀(廣州達安基因科技有限公司)、核酸分子快速雜交儀(廣東凱普生物科技有限公司)、恒溫金屬浴(杭州博日公司)、高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)。

1.3方法

1.3.1標本的采集與保存 先用消毒棉簽拭去皮損表面分泌物，以專用脫落細胞采集器采樣，采取皮損組織液及脫落細胞,將其放入裝有細胞保存液的標本管中，在管口處將多余的刷柄折斷，將刷頭留在標本管中，旋緊管蓋，于4 ℃保存，并在3 d內檢測。

1.3.2病毒DNA的提取 將采有標本的細胞保存液管振蕩混勻，取0.8 mL到EP管中，12 000 r/min離心5 min，去上清液，加入400 μL溶液Ⅰ，混勻，100 ℃裂解15 min,加入400 μL溶液Ⅱ,混勻，放置5 min,12 000 r/min離心5 min，去上清液,12 000 r/min離心1 min，再次去上清液，加入60 μL溶液Ⅲ充分溶解提取DNA。

1.3.3導流雜交技術檢測HPV-DNA 將提取的DNA用熒光定量PCR儀進行擴增，將PCR擴增產物25 μL在95 ℃變性5 min后立即冰浴2 min，再與導流雜交儀含DNA單鏈探針膜條上0.5 mL的預熱至45 ℃的雜交緩沖液混合孵育15 min，然后進行導流雜交。雜交后再用0.8 mL雜交緩沖液清洗3次，在25 ℃條件下，用封阻液封阻孵育5 min后，加入0.5 mL酶標液孵育3.5 min，用沖洗緩沖液A清洗雜交膜，去除未結合的酶標液。顯色過程加入0.5 mL NBT/BCIP底物在36 ℃保持3～5 min,顯色后1 h內分析結果，包括15種高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型)，6種低危型(6、11、42、43、44、CP8304型)。

1.4統計學處理 采用SPSS26.0統計軟件進行統計學分析。定性資料采用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HPV感染模式的性別構成 在3 303例檢測標本中，男2 101例、女1 202例，共檢出HPV陽性1 802例，檢出率為54.56%。HPV檢出率在男性和女性就診者中分別為53.26%(1 119/2 101)和56.82%(683/1 202)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=3.912,P=0.048)。單一基因型感染中男性感染低危型較女性感染比例高，差異有統計學意義(χ2=31.138,P<0.001)；多重基因型感染中，男女性均以低危型合并高危型感染為主，且女性多重基因型合并感染高于男性，兩者比例差異有統計學意義(χ2=23.753,P<0.001)，見表1。

表1 HPV感染模式在不同性別患者中構成[n(%)]

2.2HPV感染模式分析 在1 802例HPV陽性檢出者中，HPV 21種常見基因型的每個基因型都有檢出，不同基因型檢出比例見圖1。感染模式及構成情況見表2。單一基因型感染主要以6、11、16、52、58型為主；多重感染模式中二重感染以6/11、6/16、6/52、6/58型為主，3重感染以11/16/52、6/39/52、6/51/CP8304型為主，4～7重感染中各型別均為散在隨機分布，分別為67、34、15、6例；其中，四重感染中除了有5例基因型別是高危型+高危型組合外，其余4～7重感染均為低危型+高危型組合。

圖1 HPV陽性檢出者基因型別分布情況

表2 HPV陽性檢出者感染模式和基因型別分布基本情況(n=1 802)

續表2 HPV陽性檢出者感染模式和基因型別分布基本情況(n=1 802)

2.3HPV感染模式的年齡組構成 將3 303例患者分為6個年齡組，分別為<20歲，20～29歲，>29～39歲，>39～49歲，>49～59歲，>59歲,各年齡組HPV檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=12.937,P=0.024)。除<20歲和>59歲組以多重基因型感染為主，其余各組以單基因低危型感染為主；各年齡組多重基因型感染檢出率比較，差異有統計學意(χ2=41.006,P<0.001)，其中>59歲年齡組的多重基因型感染檢出率明顯高于其他年齡組。見圖2和表3。

表3 HPV感染模式在不同年齡組患者中構成[n(%)]

圖2 HPV感染不同年齡組檢出率的變化趨勢

2.4四價及九價HPV疫苗覆蓋率假設 假設本研究對象在感染HPV前預先接種HPV疫苗，則本研究納入的1 802例HPV感染者中能被四價疫苗(HPV6/11/16/18型)和九價疫苗(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58型)完全覆蓋例數分別為936例(51.94%)和1 165例(64.65%),兩種疫苗的有效覆蓋率經χ2檢驗差異有統計學意義(χ2=59.851,P<0.001)。

3 討 論

HPV是一種結構為雙鏈閉合環狀小分子DNA病毒，無包膜，屬于多孔病毒科乳頭瘤病毒屬。其感染有種屬特異性特點，主要針對人的皮膚或黏膜上皮細胞，可導致尖銳濕疣以及宮頸病變，其中高危型HPV感染是宮頸癌發生的主要因素[5,9-11,16-18]。本研究3 303例皮膚性病門診患者的HPV感染檢出率為54.56%，明顯高于國外報道的6.60%～45.20%[12,19-20]，原因可能是皮膚性病門診的多數患者為有癥狀而來就診，或因性伴感染而來體檢。本研究中單一的低危型感染檢出率較高的是6型和11型，高危型感染檢出率前5名的有16、52、58、39、51型，與國內外文獻報道的尖銳濕疣患者的HPV亞型分布相似[12,21-23]。本研究顯示多重合并感染形式有低-低危型、低-高危型和高-高危型三種，以二重低-高危型組合形式感染檢出最多。

據本研究顯示，HPV感染與患者性別因素關系非常密切，女性感染檢出率明顯高于男性，這與相關研究在2007年和2019年的研究報道一致[24-25]。在感染型別上，男性感染型別主要為6、11型等低危型，而女性感染型別主要為16、52、58型等高危型。男女HPV多重感染結果顯示，女性多重感染檢出比例明顯高于男性，而且女性比男性更容易感染多重高危型HPV，這一結果與張琰等[21]、LI等[23]對尖銳濕疣患者的流行病學調查的結果相似。

據國外報道，HPV感染檢出率隨年齡分布呈“中間低兩頭高”的U型分布，感染檢出率最低為40～49歲，兩個感染高峰分別為18～29歲和70～79歲[6]；本研究顯示感染檢出率最低為30～39歲，第1個感染高峰為<20歲，都比國外感染高峰提前了10歲左右，與國外研究稍有差異。<20歲和>59歲年齡組的感染檢出率高于其他年齡組，可見本地區HPV的感染偏向年輕化和老齡化；<20歲患者性生活活躍以及性伴不固定，但生殖系統免疫相對不夠成熟，易受HPV感染，而>59歲患者不安全性行為以及絕經期后女性免疫力下降、各項激素水平分泌較低、自身清除HPV能力降低等原因易受HPV感染[5,26]，可見應加強對HPV感染的宣傳教育、管理和干預。

大量研究表明，HPV感染是導致宮頸癌發生的主要危險因素，90%以上的宮頸癌患者有HPV感染[4-6，27]。HPV預防性疫苗主要以具有天然空間結構的合成L1晚期蛋白病毒樣顆粒(VLP)作為主要靶抗原[28]。本研究顯示九價HPV疫苗對研究人群的有效覆蓋率更高，這與成媛媛等[29]的研究結果一致，提示九價HPV疫苗可能對本地區HPV感染高危人群免疫預防保護效果更好。因此，除適齡女性應接種HPV疫苗外，給男性也接種該疫苗將減少其HPV感染，降低其罹患HPV相關惡性病變的風險。

本地區HPV感染以單基因亞型為主，低危型以6、11型多見,高危型以16、52、58型多見；九價HPV疫苗可能比四價疫苗對HPV感染人群免疫預防保護效果更好。分析HPV感染基因型分布對HPV疫苗的開發應用和防治效果的評估以及預測不典型鱗狀細胞、高危型HPV陽性而細胞學檢查陰性的患者罹患HPV相關惡性病變的風險具有參考價值。