基于雙鏈特異性核酸酶水解信號放大檢測miRNA的方法學進展*

秦薈鈞，王樹急 綜述，段曉雷，2△ 審校

1.遵義醫科大學附屬醫院醫學檢驗科，貴州遵義 563000；2.遵義醫科大學檢驗醫學院，貴州遵義 563000

微小RNA(miRNA)是一類長度約21～23 nt的短鏈非編碼RNA分子，其通過與靶向mRNA結合在基因沉默和翻譯表達中發揮作用，在基因表達調控中以及廣泛的生理、病理過程中具有重要的功能[1]。有研究表明，miRNA與腫瘤發生、發展密切相關[2]。因此，在腫瘤等疾病的早期篩查中檢測特異性miRNA具有重要的臨床意義。但是由于在發病早期或預后階段血液中某種miRNA水平極低[3]，因此臨床診斷miRNA需要高度靈敏的檢測方法。目前miRNA常見的檢測方法主要包括探針雜交與擴增技術，前者包括Northern印跡技術、微陣列芯片技術等[4]，后者有實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)、測序技術等[5]。但是由于實驗中放射性元素的使用，臨床樣品對聚合酶的抑制作用，以及所需的設備和試劑成本高等相關問題，導致傳統的miRNA檢測方法在靈敏度和特異度方面存在一定局限；而目前芯片技術雖能實現快速、高通量的檢測，但其缺點是重復性和準確性較差[6]，所以研發出高靈敏、高特異檢測miRNA的新方法尤為重要。

近幾年來，核酸等溫擴增技術發展迅速，主要包括滾環擴增技術(RCA)[7]、環介導等溫擴增技術(LAMP)[8]、催化發夾自組裝(CHA)[9]等，可以有效對靶標核酸分子進行信號放大；其中，基于雙鏈特異性核酸酶(DSN)水解反應的信號放大策略是一類比較特殊的等溫擴增技術，其具有僅水解DNA-RNA雜交鏈中DNA的特點[10]。DSN是一種降解雙鏈核酸中DNA鏈的蛋白酶，其作為非特異性DNA/RNA內切酶家族中的一員，其表現出獨特的底物選擇性[11]，DSN僅水解dsDNA或DNA-RNA雜交鏈中DNA，對單鏈DNA或RNA不裂解，且與核苷酸序列無關[10]，非常適宜檢測RNA類靶標分子。近年來，DSN水解反應被作為一種新的信號放大策略正在被逐漸廣泛用于miRNA的高靈敏度檢測中，基于DSN水解反應特性對靶標分子miRNA實現循環再利用，促使微量的miRNA觸發大量“信號分子”的釋放，從而顯著提高了檢測方法的靈敏度[12]。本文著重分析與歸納了DSN介導的比色傳感器、熒光傳感器、電化學與電化學發光傳感器檢測miRNA的方法學研究進展，幫助醫學檢驗工作者認識此類新興技術在本領域的最新發展。同時還討論了基于DSN水解放大效應檢測miRNA新方法研究所面臨的挑戰及在醫學檢驗應用中的巨大前景。

1 DSN介導的比色傳感器檢測miRNA

比色測定法為miRNA的檢測提供了快速便捷的選擇，其無需任何先進的儀器，甚至可以用肉眼觀察結果[13]。在2012年，TIAN等[14]最早成功設計出基于DSN的miRNA靈敏且便捷的比色檢測新方法。該方法主要是通過DSN水解DNA探針-miRNA雜交鏈中DNA部分，使miRNA循環利用，而DNA剩余部分形成G-四鏈體(單鏈富含G序列)與血紅素結合具有過氧化物酶活性，從而使2,2-疊氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS2-)氧化，與H2O2反應引起底物顏色變化[15]。該傳感器的優點是無需昂貴的設備即可實現靶標分子的裸眼檢測，并且在該系統中，無需標記探針就可以有效放大檢測信號?；谄錂z測優點，該方法可被開發成商業試劑盒，并用于實際樣品分析。因此，其檢測潛力非常可觀。

為了進一步構建靈敏度高與方便快捷的新型miRNA比色檢測技術，王奎宇等[16]將DSN與CHA等溫擴增技術相結合研發出一種雙重放大信號的方法。該實驗以試紙條作為信號輸出方式用于miRNA的檢測，DSN循環反應酶切釋放CHA的啟動序列并引發CHA反應，最終的產物可以在試紙條檢測線上出現紅線。該實驗的最低檢測限可達7.66 pmol/L，且能夠區分單堿基序列；這種體系以試紙條作為穩定、低廉的信號輸出方式，且無需昂貴的染料標記物，在今后miRNA的臨床診斷領域中提供了全新的檢測手段。

最近，CHOI等[17]開發了一種短時間(30 min)內快速檢測靶標miRNA的比色方法，這種檢測miRNA的高效診斷工具是基于nPfu DNA聚合酶[18]進行引物延伸來進行比色測定。該方法采用Cu2+螯合pp探針(焦磷酸鹽傳感探針)來識別引物延伸過程中產生焦磷酸鹽，然后Cu2+和焦磷酸鹽形成的復合物會從探針中去除Cu2+，從而導致顏色的變化[19]。這種巧妙的發夾結構介導的診斷方法可以通過焦磷酸鹽的傳感實現非常簡單和快速的miRNA比色檢測；該傳感器的優點在于整個檢測過程僅需要30 min，并且其在人血清中的miRNA檢測限較低，可進一步發展為床旁即時檢測(POCT)。上述這些比色傳感新方法都清晰的表明，DSN介導的比色傳感器檢測miRNA新方法正在逐步滿足診斷的重要要求：快速、高靈敏度、即時檢測，在臨床應用中顯示出廣闊前景。

2 DSN介導的熒光傳感器檢測miRNA

由于熒光傳感器具有靈活簡便、檢測限低和易于操作等特點，因此在各種靶標分子的檢測方法學研究中應用廣泛。然而，靶標miRNA通常處于低豐度狀態，常規的熒光檢測無法定量檢測出低濃度的miRNA(特別是在臨床標本中)，限制了熒光技術在低濃度miRNA檢測領域的發展。近年來，基于DSN水解反應的miRNA信號放大策略很好地解決了上述困境，DSN水解miRNA-DNA雜交雙鏈中的DNA部分，miRNA解離后可循環利用，將微量miRNA信號轉變為大量的DNA信號，再結合熒光技術的優勢，可以很好地改善低濃度miRNA檢測效果。為了設計出一種新型恒溫信號放大方法用于miRNA的高靈敏度檢測，李曉利等[20]將氧化石墨烯(GO)與DSN水解放大效應相結合。由于DSN可以水解雙鏈中的DNA而不降解miRNA，GO對酶切產生的DNA碎片吸附能力顯著降低，使得熒光基團遠離GO表面而不被淬滅，通過DSN的不斷酶切作用，熒光信號可以得到顯著放大。該方法的優點是直接方便、靈敏度高，而且全程在恒溫下進行，因此技術上易于實施。

除了結合使用常規的納米材料作為檢測miRNA外，PENG等[21]還設計了一種通過DSN輔助裂解熒光信號，再利用流式細胞術(FCM)靈敏、特異性地檢測出多種miRNA。帶有熒光納米球(FS)的單鏈DNA(ssDNA)固定在二氧化硅(SiO2)微球表面上，形成SiO2-ssDNA-FS探針；當靶標miRNA與SiO2-ssDNA-FS探針雜交后，DSN選擇性地水解ssDNA，并通過多個循環釋放FS，使得SiO2-ssDNA-FS的熒光信號明顯衰減，從而顯著提高靶標miRNA的檢測靈敏度。它還實現了對臨床血液標本miRNA的簡單、準確和定量檢測。該研究新方法的優點正是基于DSN輔助miRNA循環再利用，并借助臨床檢驗中常用的FCM技術用于miRNA檢測，并且該方法允許在體外臨床血液樣品中miRNA的多重檢測。該方法作為一種新穎的一步式淬滅熒光信號傳感器，具有較高的精確度和靈敏度，可成功檢測臨床樣品，未來該方法在腫瘤相關miRNA等的早期臨床診斷中具有巨大的潛力。

miRNA家族成員通常是高度同源的序列，甚至只有一個堿基的差異[22]，由于DSN只具有核酸雙鏈體特異性而非序列特異性，因此進一步研發基于DSN的高特異性miRNA檢測新方法至關重要。XIAO等[23]設計了一種新型的納米探針——MoS2納米材料的分子信標(MBs)用于DSN介導的miRNA高靈敏度和特異度檢測。MoS2納米材料不僅表現出對MBs的高親和力，而且還充當了MBs的有效淬滅劑[24]；MoS2與DSN結合的強淬滅熒光能力有助于該方法獲得更高的靈敏度，其檢測限(LOD)比傳統檢測方法低4個數量級；由于MBs和DSN的單堿基區分能力，還顯示出較高的選擇性，可用于區分具有單一堿基差異的同類miRNA序列；此外，裝載MoS2的MBs納米探針還可用于miRNA的多重檢測。鑒于其高靈敏度和多重檢測功能，這種新型傳感器在生物醫學研究和臨床診斷中具有廣闊的應用前景。

除了上述常規的基于DSN的熒光傳感器檢測miRNA外，還有新開發的基于磁性納米材料及以量子點為信號分子的熒光生物傳感器。目前在已經報道出多種基于DSN的miRNA檢測生物傳感器，其常常采用多種有機染料作為“信號分子”，并且他們大多數都結合一些功能強大的納米材料例如金納米(AuNPs)、氧化石墨烯(GO)、MoS2納米片等來淬滅熒光團的熒光，以設計新穎的基于DSN的miRNA生物傳感器[25-26]。由于這些檢測方法具有可量化、高靈敏度和特異度等優點，因此檢測miRNA效果更佳。研究表明，磁性納米珠(MNs)由于其優異的磁選性能，在磁芯組裝方面具有廣闊的應用前景[27-28]，并且量子點在同時檢測多種病毒核酸序列或病毒粒子方面具有獨特的優勢[29]。最近，WANG等[30]設計了一種利用磁性納米珠和量子點組裝的“衛星結構”用于檢測多種腸道病毒71型(EV71)相關的miRNA，通過記錄懸浮液中量子點的熒光信號，還可以輕松實現定量檢測。該磁性納米材料及量子點形成的“衛星結構”，結合DSN水解反應實現靶標miRNA循環，既降低了樣品污染和降解的風險，又可以同時檢測多種miRNA。目前，該方法已成功用于監測EV71感染細胞在不同時間點的miRNA表達水平，充分展示了其診斷與治療應用的潛力。

3 DSN介導的電化學傳感器檢測miRNA

電化學傳感器與熒光、比色傳感器相比，具有檢測靈敏度高、專一性強、操作簡便且能在復雜體系的臨床標本中實現miRNA檢測等優勢[31]；電化學發光法則進一步在電極表面發生電化學反應與化學發光持續循環進行，實現超高靈敏度分析與顯著光學信號檢測[32]。近年來，利用DSN水解效應放大miRNA信號并基于電化學與電化學發光平臺，研發出許多獨居匠心的新型生物傳感器。2019年，ZHUANG等[33]研發出一種偶聯捕獲探針(CPs)的AuNP修飾金電極(AuNP-AuE)的電化學生物傳感器，用于胃癌血清中miR-100的快速、靈敏和特異性檢測。當靶標miR-100與CPs在電極表面雜交，加入DSN水解雜交鏈中的CPs部分使電極的暴露產生電化學信號；該電化學傳感器對miR-100的檢測范圍為100 aM～10 pM，檢測限(LOD)大約為10 aM，且可直接用于臨床胃癌血清中的miRNA檢測，因此該方法在惡性腫瘤的早期臨床診斷中有著巨大發展潛力。

為了突破生物識別組件的保質期有限與非特異性吸附等電化學檢測中的技術“瓶頸”，WANG等[34]在電極表面共修飾金納米和銀納米顆粒(AgNPs)中成功的開發了一種高度特異性檢測靶標miRNA的電化學生物傳感器。在存在靶標miRNA的情況下，AuNPs上的DNA與miRNA雜交，加入DSN將水解雜交鏈中的DNA，裸露AuNPs允許AgNPs結合產生電化學信號；而干擾性miRNA存在時則DSN反應不發生，AuNPs上的DNA阻礙AgNPs結合而無電化學信號。該方法最大優點在于有效區分檢測靶標miRNA和干擾性miRNA，LOD低至0.62 fM，未來該傳感器可能用于miRNA相關生物醫學研究和疾病診斷的miRNA生物標志物篩選。

近年來，新型納米材料被逐漸應用于miRNA的高靈敏、高特異的電化學發光檢測研究中。2017年，南京大學的HUO等[35]利用靜電斥力和體積排斥作用研發出一種基于AuNPs修飾的DNA探針(DNA-AuNPs)與魯米諾陰離子探針、陽極氧化鋁(AAO)納米孔電極協同作用的miRNA電化學發光傳感器。當靶標miR-107存在并與AuNPs修飾的DNA探針雜交時，加入DSN可水解其中DNA部分，AAO反應膜上的魯米諾電化學發光信號增強；相反，沒有靶標miRNA時AAO反應膜上的Ru(bpy)32+電化學發光信號增強。該雙陽性信號體系可高靈敏、高特異地檢測miRNA，并調整捕獲DNA探針序列就可擴展到其他miRNA的檢測應用中。

ZHU等[36]首次提出了一種基于DSN酶切循環和量子點修飾西瓜種子狀介孔納米球的雙信號放大電化學發光(ECL)生物傳感器。通過嵌入CdTe量子點成功制備了納米微晶納米粒子(mSQSNSs)進入到二氧化硅的介孔材料從而極大增加了電化學發光的信號：當靶標miRNA存在時，AuNPs修飾的磁珠(Fe3O4@Au)表面的發卡型DNA探針被打開，加入DSN水解DNA-miRNA雜交鏈中的 DNA 部分產生連接短鏈DNA的Fe3O4@Au，并進一步與mSQSNSs耦聯形成電化學發光的二次信號放大，巨大的納米復合物富集在電化學發光電極表面產生信號。該電化學發光法檢測miRNA達到33 fM，并實現臨床血液標本檢測，為腫瘤早期篩查提供了潛在的技術工具。

4 總結與展望

綜上所述，基于DSN水解反應信號放大策略在特異性檢測體內微量濃度miRNA方面具有獨特的優勢，其只水解與miRNA互補的DNA序列，靶標miRNA得以循環再利用；這使得基于DSN的miRNA檢測分析新方法因其優越的傳感性能而備受關注[37-38]。基于DSN新方法的靈敏度和特異度與miRNA分析金標準(qRT-PCR方法)相似，但比qRT-PCR方法更快、更方便、更便宜；其結合比色、熒光、電化學、電化學發光等分析平臺，近年來已經發展出多種類型的miRNA檢測新策略和新方法?；贒SN的信號放大策略是目前提高miRNA檢測靈敏度和特異度的最有效方法之一，在特定miRNA的早期診斷中顯示出良好的潛力。

當然，盡管基于DSN信號放大策略檢測miRNA的方法學領域已經取得了許多重要進展，但是要真正實現臨床實際樣品中miRNA的高選擇性和高靈敏度的普適性檢測方法仍面臨許多挑戰。其中，與靶標miRNA結合DNA探針的設計應是目前基于DSN水解反應放大策略檢測miRNA時最大的問題，這主要是由于傳統ssDNA探針與DSN反應前后都會存在ssDNA的非特異性后續反應的假陽性信號；近年來人們逐漸引入發卡結構探針[17]、雙發卡探針[39]、G4 DNA探針[40]等抵消非特異單鏈DNA導致的假陽性。另一方面，DSN的酶活性本身有一定的局限性：DSN需要至少10 bp的雜交底物才能有效切割[41]，DSN只切割雙鏈DNA(不具有序列特異性)使得多重檢測難以實現[11]；因此，需要額外的材料、新策略來輔助提升檢測低豐度miRNA的分析靈敏度，正如本文歸納描述中的納米技術和新型材料(金納米顆粒、石墨烯、磁珠、量子點等)被大量引入基于DSN放大策略檢測MiRNA的新方法中[42-43]，用來增加探針的數量或檢測信號的強度。這些問題的逐漸解決正是未來更多新穎的DSN信號放大策略檢測miRNA的方法學研究的前進方向，科研人員不斷開發出更加靈敏、穩定、高通量的 miRNA 生物傳感器，將在腫瘤等疾病相關miRNA的臨床標本早期檢測領域中取得更加豐碩的成果。