苦參堿對缺氧/復氧小鼠海馬神經元HT22細胞活力、凋亡的影響及機制研究*

張富慧，張自艷，郝靜峰，羅 玲，王志海

邯鄲市第二醫院 1.神經內科，2.內分泌科，河北邯鄲 056001

腦缺氧/復氧(H/R)損傷引起的神經元細胞凋亡在神經功能障礙的誘導中發揮著重要作用，因此，研究神經元凋亡的機制可能有助于發現潛在的H/R治療靶點[1-2]。苦參堿是從苦參中提取的一種天然生物堿成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、神經保護等多種藥理作用[3]。研究證明，苦參堿可通過減輕中樞神經系統脫髓鞘程度來發揮對自身免疫性腦脊髓炎大鼠的治療作用[4]。苦參堿除了具有免疫調節功能外，對中樞神經系統細胞也有直接的作用。CHEN等[5]研究顯示，苦參堿能夠改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能、腦水腫和氧化應激反應，降低腦細胞凋亡率，發揮神經保護作用。腦源性神經營養因子(BDNF)是支持腦功能發育、分化、維持和終生可塑性的關鍵分子，參與神經退行性疾病和精神疾病的病理生理過程[6]。BDNF在腦H/R損傷大鼠模型中表達降低，外源添加BDNF可抑制腦H/R損傷大鼠神經元凋亡[7]。BDNF發揮其促進作用主要是通過與酪氨酸激酶受體B(TrkB)結合，導致TrkB自身磷酸化并激活下游的信號分子[8]。苦參堿是否對腦H/R損傷具有保護作用尚鮮有研究報道，因此，本文通過研究苦參堿對H/R神經元HT22細胞活力和凋亡的影響，同時初步探討潛在的分子機制，為苦參堿的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞 小鼠海馬神經元HT22細胞(上海賓穗生物科技有限公司，批號CM-4517)。

1.2主要藥物、試劑與儀器 苦參堿(成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，原料藥，純度≥99.8%，批號217-06-13)；DMEM培養基、胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號160044、160047)；噻唑藍(MTT)試劑、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒(美國Amresco公司，批號M8180-1、CA1020、MZ6127-4、ML5711-3)；化學發光試劑(美國GE公司，批號517923)；B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、BDNF、TrkB和β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Santa Cruz公司，批號HZ-061451、HZ-064782、HZ-061482、HZ-061427、HZ-066275、HZ-485251)；兔抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號115-58-264)；CO2細胞培養箱、酶標儀(上海楚定分析儀器有限公司，型號MCO-18AC、MK3)；流式細胞儀、電泳儀、凝膠成像儀(北京盛科信德科技有限公司，型號XL-MCL、FL12-DYCP-43、Platinum HD7)。

1.3實驗分組、造模及給藥 用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2條件培養HT22細胞，條件為37 ℃、5% CO2，當細胞處于對數生長期時進行實驗。實驗分組：對照組、H/R組及苦參堿低、中、高濃度組。對照組HT22細胞采用無血清DMEM培養基在正常環境下培養28 h；H/R組HT22細胞采用無血清DMEM培養基在37 ℃、5% CO2、95% N2的缺氧培養箱中維持4 h，隨后轉移到無血清DMEM培養基中，在37 ℃常氧條件下(5% CO2、95%空氣)培養24 h[9]；苦參堿低、中、高濃度組的H/R處理同H/R組，同時在無血清DMEM培養基中加入濃度分別為10、20、30 μmol/L的苦參堿進行干預[10]，培養24 h。

1.4MTT法檢測HT22細胞活力 將HT22細胞以5×103/孔接種于96孔板中(200 μL/孔)，待細胞融合后，按1.3中方法進行干預，培養結束前4 h加入MTT溶液(20 μL/孔)，繼續培養4 h，再加入100 μL二甲基亞砜均勻振蕩10 min，用酶標儀(波長600 nm處)測定吸光度值，并計算細胞存活率(細胞存活率=各處理組A值/對照組A值×100%)。

1.5流式細胞術檢測HT22細胞凋亡 將HT22細胞以5×104/孔接種于6孔板內(3 mL/孔)，待細胞融合后，按1.3中方法進行干預，添加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，檢測HT22細胞凋亡率。

1.6蛋白質印跡法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、BDNF、TrkB蛋白水平 將HT22細胞以5×104/孔接種于6孔板內(3 mL/孔)，待細胞融合后，按1.3中方法進行干預后收獲細胞，加入RIPA裂解液，冰浴2 h，離心取上清，用BCA法進行蛋白定量，調整蛋白濃度，上樣并進行電泳(每孔上樣量為20 μg)、轉膜，將膜與Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶200)、Caspase-3(1∶400)、BDNF(1∶200)、TrkB(1∶200)和β-actin(1∶1 000)一抗進行孵育，4℃過夜，添加二抗(1∶2 000)在室溫下孵育30 min，顯色，采集圖像，通過Image Lab軟件獲取信號并估計強度，以β-actin為內參計算目的蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1苦參堿對HT22細胞活力的影響 與對照組比較，H/R組HT22細胞A值、存活率降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與H/R組比較，苦參堿低、中、高濃度組HT22細胞A值、存活率依次升高，差異有統計學意義(P<0.05)，呈濃度依賴性。見表1。

表1 各組HT22細胞A值、存活率比較

2.2苦參堿對HT22細胞凋亡的影響 與對照組比較，H/R組HT22細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與H/R組比較，苦參堿低、中、高濃度組HT22細胞凋亡率依次降低，差異有統計學意義(P<0.05)，呈濃度依賴性。見表2和圖1。

表2 各組HT22細胞凋亡率比較

圖1 各組HT22細胞凋亡流式圖

2.3苦參堿對HT22細胞凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3)水平的影響 與對照組比較，H/R組HT22細胞Bcl-2蛋白水平降低，Bax、Caspase-3蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與H/R組比較，苦參堿低、中、高濃度組HT22細胞Bcl-2蛋白水平依次升高，Bax、Caspase-3蛋白水平依次降低，差異有統計學意義(P<0.05)，呈濃度依賴性。見圖2～3。

注：A為對照組，B為H/R組，C為苦參堿低濃度組，D為苦參堿中濃度組，E為苦參堿高濃度組。圖2 各組HT22細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白質印跡圖

注：與對照組比較，aP<0.05；與H/R組比較，bP<0.05；與苦參堿低濃度組比較，cP<0.05；與苦參堿中濃度組比較，dP<0.05。圖3 各組HT22細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達 水平比較(/β-actin)

2.4苦參堿對HT22細胞BDNF/TrkB信號通路蛋白表達水平的影響 與對照組比較，H/R組HT22細胞BDNF、TrkB蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與H/R組比較，苦參堿低、中、高濃度組HT22細胞BDNF、TrkB蛋白表達水平依次升高，差異有統計學意義(P<0.05)，呈濃度依賴性。見圖4～5。

注：A為對照組，B為H/R組，C為苦參堿低濃度組，D為苦參堿中濃度組，E為苦參堿高濃度組。圖4 各組HT22細胞BDNF、TrkB蛋白質印跡圖

注：與對照組比較，aP<0.05；與H/R組比較，bP<0.05；與苦參堿低濃度組比較，cP<0.05；與苦參堿中濃度組比較，dP<0.05。圖5 各組HT22細胞BDNF、TrkB蛋白表達水平比較 (/β-actin)

3 討 論

腦H/R是腦缺血再灌注的直接體現，也是導致中樞神經元損傷的主要因素之一，表現為神經元細胞存活減少，凋亡增加。如何減輕腦H/R損傷對于臨床上治療腦缺血再灌注損傷至關重要[11]。苦參堿是一種有效的針對局灶性腦缺血的神經保護劑。有研究報道，苦參堿可抑制腦缺血再灌注大鼠神經細胞凋亡來減輕局灶性腦缺血性損傷，從而發揮神經保護作用[12]。WANG等[13]發現，苦參堿可通過抑制少突膠質細胞凋亡和增強線粒體自噬發揮對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的治療作用。本研究發現，H/R組HT22細胞存活率低于對照組，凋亡率高于對照組；經苦參堿干預后，HT22細胞存活率呈濃度依賴性升高，凋亡率呈濃度依賴性降低。與趙艷武等[12]和WANG等[13]研究結果一致，表明苦參堿可通過抑制HT22細胞凋亡來保證其存活。從而保護因腦H/R導致的神經元損傷。

神經元凋亡是加速腦缺血后組織損傷的關鍵事件。眾所周知，Caspase是細胞內半胱氨酸蛋白酶家族，參與細胞凋亡的啟動和執行[14]。Caspase-3是Caspase依賴性細胞凋亡的最終效應物，研究證實在腦缺血性損傷中可觀察到神經元Caspase-3表達水平增加[15]。此外，由促凋亡和抗凋亡成員組成的Bcl-2家族蛋白對凋亡途徑和下游Caspase的激活至關重要。抗凋亡蛋白Bcl-2位于線粒體膜上，有助于維持膜的完整性并防止細胞色素C釋放到細胞質中。相比之下，促凋亡蛋白Bax是一種細胞質蛋白，當細胞受到各種凋亡刺激時，該蛋白會特異性轉移至線粒體，從而導致Bax和Bcl-2之間的不平衡。這種不平衡導致線粒體通透性變化并促進細胞色素C從線粒體釋放到細胞質，隨后激活Caspase-3導致腦缺血誘導的神經元凋亡[16]。本研究結果顯示，經H/R誘導后HT22細胞Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax、Caspase-3蛋白表達水平升高，這與以往的研究結果一致[14-16]，表明HT22細胞中凋亡途徑被激活；經苦參堿干預后，HT22細胞Bcl-2蛋白表達水平呈濃度依賴性升高，Bax、Caspase-3蛋白表達水平呈濃度依賴性降低；表明苦參堿可通過調控Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平，抑制HT22細胞凋亡，本研究支持了苦參堿具有抗凋亡活性的觀點[12-13]。

BDNF/TrkB信號通路與中樞神經系統發育過程密切相關，BDNF在腦缺血和神經元細胞凋亡中起重要作用[17]。BDNF是神經營養因子家族的一員，廣泛分布于整個大腦，是維持神經元正常生理功能、增加突觸可塑性和修復受損神經元的必要因子[18]。TrkB是BDNF的內源性受體，BDNF特異性結合TrkB受體，啟動下游的級聯反應。研究發現，當中樞神經系統受損時，腦組織BDNF和TrkB表達水平均降低[19]。激活BDNF/TrkB信號通路可降低凋亡相關蛋白Caspase-3和Bax-2的表達水平，增強Bcl-2表達水平，抑制神經元凋亡發揮神經保護作用[20]。然而，由于血腦屏障的作用，外源性給予BDNF很難進入腦組織發揮作用，因此，激活內源性BDNF的表達水平將對大腦起到保護作用。苦參堿已被報道可上調BDNF表達水平發揮神經保護作用[21]。本研究發現，H/R組HT22細胞BDNF、TrkB蛋白表達水平低于對照組，苦參堿可呈濃度依賴性的升高H/R誘導的HT22細胞中BDNF、TrkB蛋白表達水平，這與以往的研究結果一致[21]。提示，苦參堿可能通過激活BDNF/TrkB信號通路減弱H/R后的神經元凋亡發揮對HT22細胞H/R的保護作用。

綜上所述，苦參堿可改善H/R小鼠海馬神經元HT22細胞活力，抑制HT22細胞凋亡，其機制可能與激活BDNF/TrkB信號通路有關。本研究的創新之處是從體外細胞水平上闡明了BDNF/TrkB信號通路的激活可能參與苦參堿對神經元的保護作用，為苦參堿用作治療腦缺血再灌注損傷的有效神經保護劑提供了一定的理論依據。然而，腦缺血再灌注損傷后的神經元凋亡涉及多種途徑，需要進一步的研究以確定苦參堿介導的神經保護作用的分子靶點。