聚乙二醇干擾素α-2b對慢性乙型肝炎患者血清標志物HBsAg、HBV-pgRNA、HBV-RNA的影響*

劉秋紅，張麗葉，張 敏，林 潔，歐陽雁

安寧市第一人民醫院感染性疾病科，云南安寧 650302

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染影響著人類的健康，該病毒可導致肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌的發生發展。全球約有2.5億人患有HBV感染，每年可造成近100萬人死亡[1]。在HBV自然感染過程中，一些被感染者的特點是血清HBV表面抗原(HBsAg)表達水平持續較低，該人群中的大多數成員是慢性乙型肝炎(CHB)患者。過去這部分患者不主張治療，但在隨訪中發現有14%～24%可能進展為HBV e抗原(HBeAg)陰性CHB，有20%可能進展為 HBeAg陽性CHB，有高達25%的患者發生肝臟相關疾病死亡，故在篩查中發現的這些慢性HBV攜帶者采取聚乙二醇干擾素治療，療程采取個體化方案，可以達到臨床治愈(HBsAg陰性)效果。

干擾素是一種增加免疫系統活性的重要細胞因子，由活躍的Th1細胞和NK細胞分泌[2]。干擾素通過增強免疫細胞功能和促進細胞因子的表達，誘導干擾素刺激基因的產生并經干擾素信號通路編碼多種抗病毒蛋白等環節作用于HBV復制、轉錄等重要生物學過程，從而發揮免疫調節和抗病毒的雙重作用。此外，干擾素可通過增強HBV前基因組RNA(pgRNA)和核心顆粒的降解，表觀遺傳修飾共價閉合環狀DNA(cccDNA)，抑制HBV轉錄并減少HBsAg的表達水平[3-5]。因干擾素半衰期短，需每天使用，加上聚乙二醇分子后，可延長干擾素的半衰期，血藥濃度可維持1周[6]。目前市面上普遍推薦使用聚乙二醇干擾素。

HBV-pgRNA、HBV-RNA作為近段時間新發現的乙型肝炎患者血清標志物，其與聚乙二醇干擾素之間的關系尚未完全清楚。本研究旨在探究聚乙二醇干擾素α-2b(Peg-IFNα-2b)對CHB患者血清標志物pgRNA、HBV-RNA之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2018年2月至2021年12月初次確診的36例CHB患者。其中男21例，女15例，平均年齡(38.53±13.21)歲。研究者HBV檢測均為B型，HBsAg均為陽性，總膽紅素(TBIL)(26.78±3.42)μmol/L、堿性磷酸酶(ALP)(159.78±20.14)IU/L、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)(48.95±6.02)U/L、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)(41.84±4.89)U/L均在正常范圍。所有患者均接受Peg-IFNα-2b 皮下注射[(劑量<50 kg(135 μg)，≥50 kg(180 μg)]每周1次，連續治療6個月。治療前后，均進行空腹外周靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心5 min，取血清，-80 ℃冰箱保存備用。

納入標準：(1) 符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[7]診斷標準；(2)有完整的基線篩查，包括血常規、尿常規、甲狀腺功能等。排除標準：(1)不符合Peg-IFNα-2b治療指征者；(2) 妊娠期或短期內有妊娠計劃、精神病、未能控制的癲癇、嚴重抑郁癥、自身免疫性疾病、嚴重感染、心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病等；(3)甲狀腺疾病、既往有抑郁癥、未控制的糖尿病、高血壓、心臟病、人類免疫缺陷病毒感染或嚴重活動性疾病(如心臟病、大腦、腎臟疾病)者；(4)肝臟占位、肝硬化、肝癌及其他合并腫瘤疾病者。

本研究均獲得所有患者及其家屬知情同意并簽署知情同意書，經本院倫理委員會研究通過。

1.2儀器與試劑 Peg-IFNα-2b(國藥準字：S20174006)購自廈門特寶生物公司；HBV-DNA購自西安天隆科技有限公司；HBV-DNA核酸定量檢測試劑盒購自羅氏診斷公司；病毒RNA提取純化試劑盒、反轉錄試劑盒購自上海碧云天公司；TRIzol液購自美國Invitrogen公司；ABI 7300型實時熒光定量PCR檢測儀購自美國Thermo Fisher公司；實驗所有引物的合成均委托上海吉瑪公司完成。

1.3指標檢測方法

1.3.1HBsAg檢測 取出-80 ℃冰箱保存的血清，恢復至室溫，待用。按照HBsAg測定試劑盒說明書要求進行操作，檢測血清中HBsAg水平。檢測范圍：0.05～250 IU/mL；若超過檢測上限，使用HBsAg稀釋液稀釋500或1 000倍再進行檢測。

1.3.2HBV-DNA檢測 取出-80 ℃冰箱保存的血清，恢復至室溫，待用。使用HBV-DNA定量檢測試劑盒檢測HBV-DNA水平。

1.3.3HBV-pgRNA檢測 取出-80 ℃冰箱保存的血清，恢復至室溫，待用。通過病毒RNA提取純化試劑盒提取血清RNA，并用DNase Ⅰ消化。使用特異性引物、Taqman探針的qPCR實驗檢測HBV-pgRNA水平。HBV-pgRNA上游引物，5′-AYA GAC CAT CAA ATG CCC-3′，下游引物5′-ATT CTC AGA CCG TAG CAC ACG ACA C-3′；探針5′-FAM-CTT ATC AAC ACT TCC GGA RAC TAC TGT TGT TAG AC-BHQ1-3′。使用30 μL的qPCR反應體系，反應條件為95 ℃下變性5 min，然后在95 ℃持續20 s，60 ℃持續40 s，進行40個循環。所用試劑嚴格按照質量控制、防污染體系操作，保障數據的準確性。

1.3.4HBV-RNA檢測 取出-80 ℃冰箱保存的血清，恢復至室溫，待用。使用HBV-RNA定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)檢測血清中HBV-RNA水平。

2 結 果

2.1Peg-IFNα-2b治療前后患者HBsAg、HBV-DNA的表達水平 患者使用Peg-IFNα-2b治療6個月后的血清HBsAg、HBV-DNA的表達水平與治療前比較，結果見表1。與治療前相比，治療后HBsAg、HBV-DNA的表達水平均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 患者血清HBsAg、HBV-DNA的表達水平

2.2Peg-IFNα-2b調控患者血清標志物HBV-pgRNA、HBV-RNA的表達水平 結果如表2所示，與治療前相比，治療后患者血清 HBV-pgRNA、HBV-RNA的表達水平均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 患者血清 HBV-pgRNA、HBV-RNA、miR-548ah 的表達水平

2.3患者血清HBV-pgRNA、HBV-RNA與HBsAg之間的關系 為了探究HBV-pgRNA、HBV-RNA與HBsAg、Peg-IFNα-2b之間的關系，通過pearson相關性檢驗檢測Peg-IFNα-2b治療前后各個血清標志物之間的相關系數。結果如圖1所示，治療前患者血清HBV-pgRNA、HBV-RNA水平與HBsAg水平均呈正相關(r=0.751、0.702，P均<0.05)，見圖1A、B；治療后患者血清HBV-pgRNA、HBV-RNA水平與HBsAg水平也呈正相關(r=0.420、0.625，P均<0.05)。Peg-IFNα-2b治療后，HBV-pgRNA、HBV-RNA與HBsAg的相關系數均明顯的降低。

注：A為Peg-IFNα-2b治療前HBV-pgRNA與HBsAg的相關性；B為Peg-IFNα-2b治療前HBV-RNA與HBsAg的相關性；C為Peg-IFNα-2b治療后HBV-pgRNA與HBsAg的相關性；D為Peg-IFNα-2b治療后HBV-RNA與HBsAg的相關性。圖1 Peg-IFNα-2b治療前后HBV-pgRNA、HBV-RNA與HBsAg的相關性分析

3 討 論

HBV病毒復制周期復雜，其在人類肝細胞中維持病毒的持久感染。目前，已經找到了大量可靠的監測患者HBV感染的標志物，包括血清的pgRNA、HBV-RNA。HBV感染期間，病毒顆粒通過牛磺膽酸鈉共轉運多肽(NTCP)或硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)受體侵入細胞；然后，脫去表面抗原后，HBV基因組進入細胞核，形成cccDNA，作為模板指導病毒RNA轉錄[8-9]。在RNA轉錄物中，pgRNA通過聚合酶的逆轉錄酶活性進一步反轉錄到新的松弛環狀DNA(rcDNA)基因組，然后核心顆粒與細胞膜中的HBsAg相互作用，至此病毒顆粒成熟，從肝細胞中釋放[10-11]。pgRNA是一種新出現的HBV感染的血清學標志物，其作為病毒蛋白質和病毒DNA合成的模板，參與病毒生命周期的調節功能，并可能在CHB的發病機制中發揮作用[12]。據報道，pgRNA是一種新出現的HBV感染的血清學標志物，可作為CHB患者不同感染時期的診斷、預后標志物[13-15]。WANG等[16]報道，血清HBV-RNA水平與肝臟的壞死性炎癥和纖維化的組織病理學評分相關。由于血清HBV-RNA水平反映了肝內HBV-RNA的數量，它們有可能被用作病毒入侵的診斷標志物，血清HBV-RNA水平可用于準確的區分輕度和重度肝組織病理學損傷。LIU等[17]報道，在慢性HBV感染的自然過程中，血清HBV-RNA水平會發生變化，血清HBV-RNA可作為預測慢性乙型肝炎患者疾病進程的生物標志物。pgRNA、HBV-RNA還可能存在于肝癌細胞中，引起腫瘤組織中的病毒復制[18]。本研究發現，pgRNA、HBV-RNA在Peg-IFNα-2b治療后的CHB患者血清中水平均降低，說明Peg-IFNα-2b可抑制CHB血清pgRNA、HBV-RNA表達。

HBV病毒的基因型與疾病進展和IFNα治療應答有關。HBeAg陽性患者對IFNα治療的應答率，B基因型高于C基因型，A基因型高于D基因型。干擾素通過增強免疫細胞功能和促進細胞因子的表達、誘導干擾素刺激基因(ISGs)的產生并經干擾素信號通路編碼多種抗病毒蛋白等環節作用于HBV復制、轉錄等重要生物學過程，從而發揮免疫調節和抗病毒的雙重作用。此外，干擾素可通過增強HBV-pgRNA和核心顆粒的降解，或通過對cccDNA的表觀遺傳修飾來抑制HBV轉錄并減少病毒蛋白如HBsAg的表達[19-20]。干擾素療程有限，血清學應答較高且應答更持久。核苷治療后，HBsAg較低或是下降快速者，加用干擾素治療，HBsAg下降將更快；而對于高病毒載量CHB患者單用干擾素治療，如果HBsAg下降緩慢者，可同時聯用恩替卡韋或替諾福韋酯，強強聯合、優勢互補，抗病毒與免疫調控雙管齊下，治療效果更佳。目前70%以上適合干擾素治療者并未開始治療，可能與還未真正了解到干擾素治療的獲益有關。現實中干擾素治療者不到20%，有大量的臨床治愈優勢患者未曾抓住臨床治愈的時機。

綜上所述，Peg-IFNα-2b具有清除CHB患者血清HBsAg的巨大潛力，這與其抑制HBV-pgRNA、HBV-RNA的表達水平緊密相關，為Peg-IFNα-2b用于CHB的治療提供理論支持。