黏蛋白乳化劑在1 418例細胞蠟塊制備技術中的應用研究*

吳燕杏，毛榮軍，莫超華，韓福蘭，曾 敏，陳增偉

佛山市中醫院病理科，廣東佛山 528000

細胞病理學技術是一種疾病的病理學診斷和研究方法，該方法具有操作簡便、患者痛苦少、易于接受等優點。早期的細胞學制片技術，主要是細胞涂片法和離心后直接取細胞沉淀物包埋法(如離心管沉淀法、冷凍細胞塊制備法、試管包埋法、載玻片細胞聚集法等)[1]。劉芳等[2]研究報道，細胞涂片法易出現涂片厚薄不一，細胞重疊和細胞松散，背景較深等現象，造成診斷困難。TOBAR等[3]研究認為，離心后直接取細胞沉淀物包埋法由于沒有介質把細胞凝聚在一起，對細胞量少的標本制作效果極差。而對細胞量較多的標本也容易在切片過程中出現掉片，造成染色不良，影響病理診斷結果。

近年來，使用瓊脂、蛋清、凝血酶等制備細胞塊的技術陸續被報道，這些介質材料聚攏并提高了細胞數量，但是存在一定的局限，技術上改變了組織固定、脫水、透明、浸蠟的時間，操作繁瑣，實驗條件需要摸索[4]，也可能會對后續的免疫組織化學染色(IHC)等實驗結果造成影響[5]。迄今為止，沒有一種“金標準”的介質材料和制作細胞塊的操作流程被指南或者專家共識所認可。本研究的黏蛋白是一種不含任何分子結構的介質材料，本研究收集了1 418例非婦科細胞學標本，探討了黏蛋白乳化劑制備的細胞塊在蘇木素伊紅(HE)染色、IHC的效果和診斷價值，旨在為推廣一種操作便捷、成本低、富集率高、形態好、診斷價值高的細胞塊制備技術提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選取2018年7月至2022年1月本院送檢的1 418例細胞學標本為研究對象，使用黏蛋白乳化劑作為基質材料制備細胞塊，制作石蠟切片和HE染色，由兩位資深病理醫師對細胞塊作出組織學診斷，對其中細胞塊診斷為惡性的285例標本再次切片并進行相關免疫組化檢測2 138項。患者年齡19.86～85.61歲，平均(49.85±18.32)歲。1 418例標本按照細胞標本來源的不同分為脫落細胞學標本1 183例(83.43%)和細針針吸細胞學標本235例(16.57%)。脫落細胞學標本分為胸腹腔積液572例(48.35%)、乳腺溢液153例(12.93%)、痰液128例(10.82%)、尿液104例(8.79%)、支氣管鏡灌洗液97例(8.20%)、盆腔積液75例(6.34%)、心包積液54例(4.57%)。細針針吸細胞學標本分為甲狀腺127例(54.04%)，乳腺85例(36.17%)，淋巴結23例(9.79%)。細胞塊病理診斷為惡性的285例標本按照病理類型分為腺癌115例(40.36%)，乳頭狀癌88例(30.87%)，轉移癌59例(20.70%)，鱗癌23例(8.07%)。1 418例患者均有術后病理診斷結果作為對照。本研究獲得患者知情同意和本院醫學倫理委員會批準。

1.1.2儀器與試劑 ASP6025全自動真空組織脫水機、HistoCore Arcadia H 熱石蠟包埋機、RM2235手動輪轉式切片機、ST5020多功能染色機購自德國徠卡儀器有限公司。JH-18S全自動免疫組化染色儀購自上海杰浩生物技術有限公司。TLXJ-IIC 低速臺式大容量離心機購自上海安亭科學儀器廠。BPG-9070A精密鼓風干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司。黏蛋白(貨號：FJ702510，CAS：84082-64-4)購自安徽酷爾生物工程有限公司。HE染色液購自無錫市江原實業技貿有限公司。免疫組織化學染色一抗和二抗購自上海杰浩生物技術有限公司。甲醛溶液購自廣州維格斯生物科技有限公司。乙醇購自廣東光華科技股份有限公司。二甲苯購自廣州化學試劑廠。

1.2方法

1.2.1黏蛋白乳化劑制備細胞塊的方法 非婦科標本放置在標準50 mL錐形離心管中，2 500 r/min離心5min,棄上清液(對于細胞量不足的標本，可多次重復離心；對于血性標本，可加入紅細胞裂解液30 mL后進行離心)，加入甲醛-乙醇(AF)液5 mL，2 500 r/min離心5 min,棄上清液后保留1 mL沉淀物，加入10%黏蛋白乳化劑250 μL(黏蛋白乳化劑與標本的混合比例為1∶4)，混勻,2 500 r/min離心5 min,棄上清液，離心管底部可見細胞塊呈膠體狀態，用塑料鏟輕輕取出沉淀細胞塊放入包埋盒。

1.2.2HE染色及切片質量評價標準 細胞塊參考中華醫學會推薦的常規石蠟切片制備程序進行固定、脫水、透明、包埋、切片和HE染色[6]。常規石蠟包埋-HE染色切片質量的評價標準[7]，包含：組織切面完整度和切片切面數(10分)、切片厚薄度和均勻度(10分)、切片完整度(10分)、切片平坦度(10分)、切片純凈度(10分)、切片整潔度(10分)、切片透明度(10分)、染色清晰度(10分)、裱片位置恰當度(10分)、切片標簽貼放正確度(10分)。優質片：≥90分；優良片：75～89分；基本合格片：60～74分；不合格片：≤59分。切片優良率=[(優質片數+優良片數)/總切片數]×100%]。

1.2.3免疫組織化學染色方法及評價標準 免疫組織化學染色流程：石蠟切片烤片(68 ℃，15 min)，脫蠟至水，根據一抗的要求，對組織進行抗原修復,切片上滴加0.3%H2O2，孵育10 min，PBS沖洗，滴加一抗，孵育60 min，PBS沖洗,滴加二抗，孵育15 min，PBS沖洗，滴加DAB 顯色試劑，HE復染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍，二甲苯透明，中性樹膠封片。評價標準[8]，包含(1)優質片：定位精準，背景清晰，著色恰當，呈特異性著色；(2)優良片：定位較精準，背景較清晰，著色較合理，有少量非特異性染色；(3)不合格片：抗原彌散現象嚴重，著色不合理，出現大量非特異性染色。切片優良率=[(優質片數+優良片數)/總切片數]×100%]。

2 結 果

2.1黏蛋白乳化劑制備的細胞塊及切片的外觀大體情況 肉眼可見，黏蛋白乳化劑制備的1 418例非婦科細胞學標本的細胞塊制作成功率是100.00%，細胞塊外觀呈圓形果凍樣膠體的結構、細胞聚集成團、硬度適中，見圖1A。黏蛋白乳化劑制備的細胞塊切片外觀完整、呈規則的圓形結構、疏松度適中，見圖1B。

注：A為黏蛋白乳化劑制備的細胞塊外觀；B為黏蛋白乳化劑制備的細胞塊石蠟切片外觀。圖1 黏蛋白乳化劑制備的細胞塊及石蠟切片外觀情況

2.2黏蛋白乳化劑制備的細胞塊石蠟切片HE染色和IHC染色的顯微鏡下情況 顯微鏡下可見，黏蛋白乳化劑制備的細胞塊能連續均勻切片，HE染色背景清晰，核漿著色鮮艷，紅藍分明，對比清晰，細胞核呈藍色，細胞質、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細菌可呈藍色或紫藍色。細胞均勻分布于圓形區域內，細胞形態呈現立體感，見圖2A1、A2。

注：A1為甲狀腺乳頭狀癌，上皮樣細胞呈腺樣排列，細胞排列擁擠，細胞核大，核膜增厚、不規則，核染色質淡染，可見核溝。 B1為CK19示瘤細胞胞質彌散強陽性。A2為單核組織細胞源性細胞，大量的胞質紅染的上皮樣細胞，細胞體積較大，胞漿內可見空泡，細胞核形態不規則，部分細胞核偏位。B2為大部分上皮樣細胞CD68陽性。圖2 黏蛋白乳化劑制備的細胞塊石蠟切片HE染色(HE法×100)和IHC染色(SP二步法×100)的顯微鏡下情況

顯微鏡下可見，黏蛋白乳化劑制備的細胞塊石蠟切片厚薄均一，IHC染色的背景干凈，呈特異性染色。主要表現在兩方面：第一，特異反應產物分布于特定的部位，即具有結構性。第二，特異性產物在同一切片上呈現不用程度陽性染色結果，即具有細胞性。見圖2B1、B2。

2.3黏蛋白乳化劑制備的細胞塊HE染色和IHC染色切片優良率 HE染色切片共1 418張，分別為：優質片1 142張(80.54%)、優良片261張(18.40%)、基本合格片12張(0.85%)、不合格片3張(0.21%)，HE 染色切片優良率為98.94%。IHC染色加片為2 138張，分別為：優質片1 729張(80.87%)、優良片394張(18.43%)，不合格片15張(0.70%)，IHC染色切片優良率為99.30%。

2.4黏蛋白乳化劑制備的細胞塊的診斷效能 本文以患者術后病理診斷為癌的294例標本作為金標準的陽性病例，1 124例病理學診斷結果為非癌的標本作為金標準的陰性病例。黏蛋白乳化劑制備的細胞塊診斷靈敏度為96.94%；特異度為100.00%；符合率為99.37%；約登指數為0.9694。

3 討 論

診斷細胞學是通過采集病變處的細胞，染色后觀察細胞結構和形態變化來診斷和研究臨床疾病的一門學科。細胞塊制片是早期的涂片診斷的進一步優化，該技術能為細胞學的病理診斷提供更優質的技術，是臨床疾病診斷的強有力支持依據。隨著臨床送檢標本的日益多樣化和復雜性，給傳統的涂片技術提出了嚴峻的挑戰。簡單的離心沉淀細胞塊制作技術應運而生，但是，該方法存在諸多不足，如：細胞較多的標本，容易發生細胞相互擠壓嚴重的現象，影響細胞形態學的辨別；細胞量少的標本，非常容易發生細胞丟失的現象，反復的離心也不能制成細胞塊[9]。國內外學者開始嘗試在離心沉淀的細胞中加入不同的基質材料，取得一定的進步，但仍然存在較多問題，如：操作過程復雜、制片困難、切片掉落、細胞形態變異、背景較深、嚴重影響病理診斷結果[10-11]。因此，目前仍然缺乏一種細胞塊的制作的“金標準”方法。

MELEGA 等[12]研究報道，瓊脂、HistoGel和Collodio等基質材料制備的細胞塊法操作過程繁瑣，后續固定、脫水、透明、浸蠟等實驗條件較復雜，制作的石蠟切片質量不穩定。與之不同的是，本研究細胞塊制作程序較為便捷，無須改變原有的處理組織程序和使用特殊的機器，黏蛋白價格適中。本研究的1 418例非婦科細胞學標本的細胞塊均制作成功說明了黏蛋白乳化劑制備細胞塊的富集效率較高，細胞丟失較少。與陳淑霞等[13]報道的25例眼內玻璃體液細胞蠟塊制作成功率是100.00%的研究結論一致。但是，本研究納入的病例數較多，標本來源更廣，囊括了臨床送檢的胸腹腔積液、乳腺溢液、痰液、尿液、支氣管鏡灌洗液、盆腔積液、心包積液、甲狀腺、乳腺和淋巴結穿刺等標本。因此，本研究結果更嚴謹，臨床適用性更強。筆者在研究過程中發現，對于部分細胞量較少，第一次離心后肉眼觀無明顯沉淀物的標本，建議適當提高轉速至3 000 r/min，重復離心3～5次，直至滿足實驗的要求。

黏蛋白乳化劑制備的細胞塊石蠟切片HE染色和IHC染色的形態學效果符合行業標準，均能滿足三甲醫院的病理學診斷的需求。胡沙沙等[14]使用一種專用包埋盒、專用的細胞塊數控離心包埋機和特殊的“膠”制作了300例細胞塊。張巧全等[15]使用乙醇為還原劑，戊二醛為固定劑，4 ℃條件下制備了26例腦膜癌的細胞塊。高麗麗等[16]使用試劑盒制備了40例胸腹腔積液脫落細胞標本的細胞塊。上述文獻報道的細胞塊石蠟切片HE染色和IHC染色形態學染色效果與本研究的基本一致。不同的是，本研究使用的是自行配制的黏蛋白乳化劑，非商品化的試劑盒，亦無須購買特殊的設備，檢測成本低，操作流程簡便，染色效果佳，有利于在各個層次醫療單位病理科推廣使用。值得注意的是，PARK等[17]報道瓊脂水平在2.00%～5.00%制備的細胞塊硬度適中，細胞塊與蠟塊融合良好。而本研究摸索的黏蛋白乳化劑最佳濃度是10.00%，即黏蛋白5 g∶50 mL蒸餾水。本研究發現黏蛋白濃度太低，細胞塊無法凝結和包埋。反之，黏蛋白濃度太高，細胞塊會偏硬和偏脆，細胞塊和石蠟融合不好，其間部分石蠟松浮，在切片時就使蠟片，造成切片質量下降明顯。

本文的細胞塊HE染色和IHC染色切片優良率均大于98.00%，達到了三甲醫院的行業標準。鄧雪琴等[18]用小牛血去蛋白凝膠試劑盒制備了5例胸腹腔積液的細胞蠟塊，其HE染色和CK7、TTF1染色均取得了理想的效果。而本研究嚴格按照病理專業醫療質量控制指標的標準[19]，對HE染色和IHC染色切片優良率做了數據統計分析，實驗數據反映的是黏蛋白乳化劑制備的細胞塊歷經固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色和IHC染色和封片后的效果。

本文以患者術后病理診斷結果為金標準，結合靈敏度、特異度、符合率和約登指數等診斷評價指標，綜合評估認為：黏蛋白乳化劑制備細胞塊的診斷效能較高。其操作過程較簡單，成本低，細胞塊制作效果佳，可滿足HE和IHC染色診斷的需求，可對細胞塊進行連續切片，可長期保存，與組織學診斷的符合率高，應用前景廣闊。尤其是對于一些組織學無法獲得標本的疾病的早期診斷，黏蛋白乳化劑制備的細胞塊是組織學診斷的有益補充。

當然，本研究也存在一些不足，本研究的標本來源于單中心實驗室的研究，標本類型仍然不夠豐富。后續實踐中，本研究將積極爭取多中心醫療合作，拓展標本來源，如延伸到組織間液、腦脊液、眼內玻璃體液等標本的研究，繼續摸索黏蛋白乳化劑制備的細胞塊在分子病理領域，如熒光原位雜交(FISH)、顯色原位雜交(CISH) 、基因重排、 DNA甲基化、 基因突變檢測、微衛星不穩檢測的效果,以助于疾病的診斷、指導個體化治療、預后的監控，為患者的精準細胞學診斷提供強力保障。