circ-ITCH抑制結直腸癌細胞增殖和轉移的作用機制研究*

蔡沾煥,陳 升,蘇學良

儋州市人民醫院/海南醫學院附屬儋州醫院普外科，海南儋州 571700

結直腸癌(CRC)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，占男性惡性腫瘤發病率的第二位和女性的第三位，以及男性惡性腫瘤相關死亡的第三位和女性的第四位[1]。隨著診斷和治療技術的不斷提高，CRC患者的五年生存率有所改善，但是腫瘤患者的五年生存預后與疾病的進展階段高度相關。晚期CRC患者通常伴有腫瘤轉移，五年的存活率非常低[2]。因此，本文迫切需要進一步研究CRC的發病機制和腫瘤轉移中的未知分子機制。環狀RNA(CircRNA) Itchy E3泛素蛋白連接酶(Circ-ITCH)是新近發現的腫瘤抑制CircRNA之一，目前已經發現Circ-ITCH在常見惡性腫瘤乳腺癌[3]和消化道常見惡性腫瘤胃癌、肝細胞肝癌等[4-5]多種腫瘤中表達水平降低，抑制腫瘤細胞的增殖和轉移能力，Circ-ITCH是否抑制CRC細胞的增殖和轉移能力未知。Wnt/β-catenin信號通路傳導的異常激活與人類惡性腫瘤的進展有關，尤其是CRC[6]。Circ-ITCH在乳腺癌、肝細胞肝癌和甲狀腺乳頭狀癌中通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮抑癌作用[3,5]，提示Circ-ITCH在CRC中可能與Wnt/β-catenin信號通路相關。因此本文致力于研究Circ-ITCH通過調控Wnt/β-catenin信號通路抑制CRC的惡性進展，以期發現Circ-ITCH作為干預CRC治療分子靶點的重要實驗室依據。

1 材料與方法

1.1主要材料 納入在本院確診的CRC患者82例。患者組織標本新鮮，立即采用液氮凍存。納入標準：(1) 接受根治性疾病的CRC患者，包括收集腫瘤組織和相鄰的正常組織(距離腫瘤5 cm)； (2) 病理明確為CRC ；(3) 患者臨床資料包括年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤分級、TNM分期的臨床參數及預后資料；排除標準：(1)接受過全身治療或局部治療；(2) 合并另一種惡性腫瘤； (3)患有嚴重威脅生命健康的基礎疾病。本研究根據赫爾辛基宣言獲得所有受試者書面知情同意書，并已經獲得本院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 Trizol 試劑(15596-018)和Lipofectamine 2000(11668)試劑購自美國Invitrogen公司；Circ-ITCH和GAPDH引物均由廣州Ribobio公司設計和合成；逆轉錄試劑盒(A3500)購自美國Promega公司；Sybr Green PCR試劑盒(RR820A)購自日本Takara公司；SW480、SW620和HT29及正常結腸細胞NCM460細胞購自美國ATCC細胞庫；RPMI-1640培養基(61870036)和胎牛血清(10099141C)均購自Thermo Fisher Scientific公司；Leibovitz′s L-15(MFCD00217482)購自美國sigma公司；McCoy′ 5A培養基(FS-5045P)購自上海撫生試劑公司；胰酶(T8150)、青霉素(P8010)、鏈霉素(3810-74-0)、CCK8試劑(CA1210)和細胞裂解緩沖液(DgcX8ocR)購自北京索萊寶科技有限公司；空載質粒和Circ-ITCH過表達轉染質粒購自廣州Ribobio公司；Transwell小室(3413)購自美國Corning公司；增強型 ECLTM檢測試劑盒(KGP1128)購自中國南京KeyGene公司；BCA蛋白檢測試劑盒(23227)購自美國Thermo試劑公司；PVDF膜(1620177)購自美國BioRad公司；β-catenin(ab32572)cyclinD1(ab16663)、cMyc(ab32072)、轉移相關蛋白基質金屬蛋白酶(MMP，ab92536)2、MMP9(ab76003)、GAPDH(ab8245)和兔二抗(ab32072)、鼠二抗(ab279289)均購自英國Abcam公司。

1.3實驗方法

1.3.1實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 使用Trizol試劑從組織中提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒并根據說明書進行RNA至 cDNA的逆轉錄。以 cDNA為模板使用Sybr Green PCR試劑盒配制PCR反應體系，選擇GAPDH作為對照，采用 Applied Biosystems 7900HT 序列檢測系統檢測Circ-ITCH和GAPDH 的表達水平。 使用2-ΔΔCt方法量化Circ-ITCH表達。引物序列：Circ-ITCH 正向引物：5′-GTT GGT CAA TCG CCT GCT A-3′，反向引物：5′-GGT CCC GCA CAG GGG TA-3′;GAPDH 正向引物：5′-TCA AGA AGG TGG TGA AGC A-3′ ，反向引物：5′-AGG TGG AGG AGT GGG TGT-3′。

1.3.2細胞培養和轉染 CRC細胞SW480和NCM460在RPMI-1640 培養基中培養；SW620細胞在Leibovitz′s L-15培養基中培養；HT29在McCoy′ 5A培養基中培養。各種培養基中均含有10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素，放置在37 ℃含有5% CO2的濕潤培養箱中培養。細胞長滿后采用qRT-PCR檢測各組細胞中Circ-ITCH的表達水平。

選擇低表達Circ-ITCH的SW620細胞，計數2×105個/孔，接種至6孔板中培養。隨機分為對照組(NC組)和實驗組(Circ-ITCH組)。細胞貼壁后，采用Lipofectamine 2000按照說明書進行轉染，首先將Lipofectamine 2000 試劑與培養基混勻后靜止5 min，然后分別與空載質粒和Circ-ITCH過表達轉染質?；旌虾螅D染至NC組和Circ-ITCH組中。放置在 37 ℃含有5% CO2的濕潤培養箱中轉染48 h，qRT-PCR檢測Circ-ITCH 過表達轉染質粒轉染效果。

1.3.3細胞計數試劑8(CCK8)實驗 采用CCK8試劑檢測細胞增殖能力。收集NC組和Circ-ITCH組細胞，在200 μL培養基中以2×103個細胞的密度接種至96孔板細胞中，設置24、48和72 h，并每組設置6個平行復孔，放置在 37 ℃含有5% CO2的濕潤培養箱中培養。分別在對應的時間點更換100 μL 培養基和10 μL CCK8試劑，混勻后在37 ℃下處理2 h。采用酶標儀檢測各細胞在450 nm處測定吸光度值(A值)。

1.3.4Transwell實驗 采用Transwell小室檢測細胞轉移能力。收集NC組和Circ-ITCH組細胞，無血清培養基洗3次后，在100 μL無血清培養基中以1×106個細胞的密度接種至24孔板中的Transwell小室上。24 孔板的下室中加入含有500 μL的10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基，每組設置3個平行復孔，放置在 37 ℃含有5% CO2的濕潤培養箱中培養10 h。取出Transwell室，棄去孔中的培養基并用PBS洗滌。 然后，將細胞用甲醇固定30 min并用0.1%晶體染色20 min。使用棉拭子輕輕擦拭上未轉移的細胞，并在顯微鏡下計數。

1.3.5TOP/FOP 雙熒光素酶實驗 采用TOP/FOP 雙熒光素酶實驗檢測細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性。收集NC組和Circ-ITCH組細胞，在200 μL培養基中以2×103個細胞的密度接種至96孔板細胞中，采用PRL-TK質粒(每孔10 ng)和TOP/FOP質粒(每孔200 ng)共轉染。在轉染48 h后，采用雙熒光素酶報告器測定系統分析各組細胞中熒光素酶發光強度。

1.3.6Western-blot實驗 采用含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解RIPA緩沖液提取各組細胞中的細胞總蛋白，并采用BCA 蛋白檢測試劑盒定量蛋白質濃度。蛋白質煮沸變性后，通過SDS-PAGE凝膠分離蛋白質并轉移至PVDF膜。在用5%的非脂肪牛奶封閉后，將膜在4 ℃下與初級抗體一起溫育過夜。HRP標記的二抗體用于在室溫下孵育2 h。通過增強型 ECLTM檢測試劑盒可視化蛋白質條帶。一抗抗體稀釋液∶抗β-catenin(1∶500)，抗cyclinD1(1∶1 000)，抗cMyc(1∶500)，抗MMP2(1∶1 000)，抗MMP9(1∶1 000)，抗GAPDH(1∶1 000)。

2 結 果

2.1Circ-ITCH表達與CRC患者病理參數的關系 qRT-PCR檢測Circ-ITCH在CRC組織中的表達水平(1.24±0.65)低于在癌旁組織中的表達水平(1.56±0.78)，差異有統計學意義(t=2.643,P=0.010)，見圖1A。t檢驗分析Circ-ITCH與CRC患者病理參數的關系，結果顯示高表達水平Circ-ITCH與CRC患者年齡、性別、腫瘤最大徑、分化程度均無關(P>0.05)，與患者淋巴結轉移和TNM分期相關(P<0.05)，見圖1B～C和表1。

注：A為Circ-ITCH在CRC和癌旁組織中的表達，與癌旁組織相比，*P<0.05；B為Circ-ITCH在有無淋巴結轉移CRC組織中的表達，與無淋巴結轉移CRC組織相比，*P<0.05；C為Circ-ITCH在不同TNM分期CRC組織中的表達，與TNM Ⅰ～Ⅱ期組織相比，*P<0.05。圖1 qRT-PCR檢測結果

表1 Circ-ITCH蛋白在CRC組織中的表達水平與臨床病理參數之間的關系

2.2Circ-ITCH的表達水平與CRC患者預后的關系 Log-Rank法進行統計檢驗顯示與低表達Circ-ITCH的CRC患者相比，高表達Circ-ITCH的CRC患者預后較差(χ2=4.195，P=0.041)，見圖2。

圖2 Log-Rank檢驗分析Circ-ITCH在CRC組織中表達與患者預后的關系

2.3Circ-ITCH 在CRC細胞中的表達水平 qRT-PCR檢測Circ-ITCH在SW480、SW620和HT29及正常結腸細胞NCM460中的表達水平分別為(0.31±0.10)、(0.18±0.04)、(0.53±0.08)和(1.00±0.01)，Circ-ITCH在CRC細胞中的表達水平低于在正常結腸細胞NCM460中的表達水平，在SW620細胞中的表達水平最低(P<0.041)，見圖3A。Circ-ITCH在NC組和Circ-ITCH組SW620細胞中的表達分別為(1.00±0.01)、(5.49±1.10)，Circ-ITCH在Circ-ITCH組SW620細胞中的表達水平增加(t=5.821，P=0.004)，見圖3B。

注：A為Circ-ITCH在CRC細胞中的表達水平低于在正常結腸細胞NCM460中的表達水平，與NCM460組相比，*P<0.05；B為與NC組相比，Circ-ITCH組SW620細胞中Circ-ITCH的表達水平增加，與NC組相比，*P<0.05。圖3 qRT-PCR檢測結果

2.4細胞增殖能力檢測 采用CCK8檢測顯示與NC組相比，Circ-ITCH組CRC細胞SW620的增殖能力降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

與NC組相比，*P<0.05。圖4 細胞增殖能力檢測

2.5 細胞轉移能力檢測 采用Transwell實驗檢測顯示NC組和Circ-ITCH組SW620細胞轉移數目分別為(64.67±4.64)個和(23.67±4.99)個。與NC組相比，Circ-ITCH組SW620細胞的轉移能力降低，差異有統計學意義(t=8.508，P=0.001)，見圖5。

注：與NC組相比，*P<0.05。圖5 細胞轉移能力檢測

2.6Wnt/β-catenin信號通路檢測 采用TOP/FOP 雙熒光素酶實驗檢測顯示NC組和Circ-ITCH組SW620細胞中TOP/FOP 雙熒光素酶活性分別為(0.99±0.03)個和(0.47±0.08)個。與NC組相比，Circ-ITCH組SW620細胞中Wnt/β-catenin信號通路活性降低，差異有統計學意義(t=25.220，P<0.001)，見圖6。

注：與NC組相比,*P<0.05。圖6 Wnt/β-catenin信號通路檢測

2.7Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白檢測 采用Western-blot實驗檢測顯示與NC組相比，Circ-ITCH組SW620細胞中Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白β-catenin核表達水平及其下游增殖相關蛋白cyclinD1、cMyc和轉移相關蛋白MMP2、MMP9的表達水平均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

注：與NC組相比，*P<0.05。圖7 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白檢測

3 討 論

在人類基因組中存在大量的非編碼RNA，并且非編碼RNA和人類疾病，尤其是惡性腫瘤之間存在的關系始終是研究的熱點。CircRNA是非編碼RNA的重要成員，通過替代剪接形成內源性RNA，具有共價閉合的環形結構，不存在3′和5′末端，使得CircRNA非常穩定，不易被內切核酸酶降解[7]。目前已經在真核生物中檢測到超過20 000個CircRNA，并且隨著高通量測序技術的發展，在不同的組織中越來越多的CircrNA被鑒定，其在疾病發展中的作用也逐漸被發現。目前研究結果已經表明CircRNA參與了幾乎所有類型惡性腫瘤的發展，同時CircRNA可能是惡性腫瘤新的潛在生物標志物和治療目標[8]。然而大多數CircRNA在惡性腫瘤進展中的功能仍然是未知的，因此研究CRC惡性進展中表達異常并發揮重要功能的CircRNA，對尋求抗CRC治療的分子靶點具有重要意義。

Circ-ITCH是一種從位于20號Q11.22染色體上的基因Itchy E3泛素蛋白質連接酶的幾個外顯子產生的CircrNA，由BERNASSOL等[9]首次研究并報道。Circ-ITCH在乳腺癌及膀胱癌組織和細胞系中表達受到抑制，低表達Circ-ITCH的乳腺癌和膀胱癌患者的存活率降低[3,10]。WANG等[11]報道Circ-ITCH低表達水平與前列腺癌PSA、腫瘤分期和GLEASEN分數高度相關。但是Circ-ITCH在CRC中的表達及臨床意義未見有報道，本文收集CRC組織標本，檢測結果顯示Circ-ITCH在CRC組織中的表達水平低于癌旁組織，并且統計分析顯示Circ-ITCH低表達水平與CRC患者淋巴結轉移和TNM分期相關，且Circ-ITCH低表達水平的CRC患者預后較差，提示Circ-ITCH在CRC中發揮抑癌作用，可作為CRC患者預后不良的生物標志物。同時一項Meta分析顯示Circ-ITCH低表達惡性腫瘤患者更容易發生淋巴結轉移、腫瘤最大徑更大、TNM分期更晚、整體存活率更差，表明Circ-ITCH低表達與惡性腫瘤侵襲性臨床病理特征和各種不利結果相關，可以用作人類惡性腫瘤中的分子治療靶標和預后標志物[12]。這表明研究Circ-ITCH在CRC中發揮具體的生物學功能具有重要的意義。在乳腺癌、胃癌和卵巢癌等惡性腫瘤中Circ-ITCH抑制細胞的增殖和轉移能力[3-4,13]，那么Circ-ITCH是否抑制CRC細胞增殖和轉移能力。首先檢測Circ-ITCH在CRC細胞中的表達水平低于正常結腸細胞NCM460，并且選擇表達水平最低的CRC細胞轉染Circ-ITCH過表達質粒，CCK8和Transwell實驗結果顯示過表達Circ-ITCH后，CRC細胞的增殖和轉移能力降低，表明Circ-ITCH抑制CRC的惡性進展，與其他惡性腫瘤中的報道一致[3-4,13]。但是Circ-ITCH在CRC中發揮作用的機制需要進一步研究。

CircRNA廣泛參與形成RNA蛋白復合物的形成，其充當miRNA海綿是作為調節靶基因轉錄的重要作用機制，除此以外CircRNA可以通過調控信號傳導途徑和影響基因的表達發揮作用[8]。在膀胱癌中Circ-ITCH通過調節miR-17和miR-224靶基因P21和PTEN在體外和體內抑制細胞增殖、遷移、侵襲和轉移能力[10]。而Circ-ITCH抑制乳腺癌、肝細胞肝癌和甲狀腺乳頭狀癌惡性進展的作用機制均為抑制Wnt/β-catenin信號通路[3,7]。經典Wnt/β-catenin信號通路在調節增殖、分化和細胞命運對腸道穩態進行至關重要的作用，其在CRC中異常激活，促進腫瘤惡性進展，是抗CRC治療的重要關鍵靶點[6]。TOP/FOP雙熒光素酶是檢測Wnt/β-catenin信號通路活性的重要手段，本文通過TOP/FOP雙熒光素酶檢測發現過表達Circ-ITCH后，CRC細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性增加。研究顯示β-catenin從細胞質中移至細胞核中，是激活Wnt/β-catenin信號通路的關鍵，且核β-catenin蛋白表達升高被認為是CRC侵襲的標志，激活Wnt/β-catenin信號通路相關的靶標，包括增殖相關蛋白cMyc，Cyclin D1和轉移相關蛋白MMP2、MMP9，從而促進細胞增殖和轉移能力[14-15]。本文采用Western-blot實驗檢測顯示過表達Circ-ITCH后，CRC細胞中核β-catenin蛋白表達水平降低，以及增殖相關蛋白cMyc，cyclin D1和轉移相關蛋白MMP2、MMP9表達水平均降低。本研究表明Circ-ITCH 通過調控Wnt/β-catenin信號通路抑制CRC的惡性進展。

綜上所述，Circ-ITCH在CRC組織和細胞中的表達水平降低，與CRC患者不良病理參數和預后相關。Circ-ITCH 通過調控Wnt/β-catenin信號通路抑制CRC細胞的增殖和轉移能力。Circ-ITCH具有作為CRC不良預后生物標志物和抗腫瘤治療分子靶點的潛力。