核酸依賴性擴增技術研究現狀及展望

李錦澎 綜述,吳 蓉 審校

1.上海中醫藥大學附屬普陀醫院檢驗科,上海 200062；2.上海市普陀區中心醫院檢驗科,上海 200062

核酸擴增技術常常用于一些基因鑒定、親子鑒定、病原微生物學等的檢測。基于聚合酶鏈式反應(PCR)原理而開發出來的各式各樣的核酸擴增技術已被廣泛使用，如普通PCR、熒光定量PCR等。PCR技術雖然具備特異度高、靈敏度強的特點，但是因其實驗操作繁雜、對環境設備要求較高、實驗時間長等缺點，其應用范圍(如地方醫療、即時醫療等)受到一定的限制，而等溫核酸擴增技術則應運而生。自1990年以來，已經開發了十多種等溫核酸擴增技術以求替代PCR技術，如環介導的等溫核酸擴增技術、核酸依賴性擴增(NASBA)技術、鏈置換擴增技術、單引物等溫擴增技術等。這些技術各具特點且無需繁雜操作步驟與要求嚴格的設備和環境，只需5～120 min的時間和適合的水浴溫度，就能實現核酸的快速擴增并用于后續的檢測。因此，快速了解等溫擴增技術的近年研究進展，對技術的進一步研究具有重要的科學研究意義。本文就等溫擴增技術中NASBA技術近五年來的技術研究及改良進行概述。

1 NASBA技術

1.1基本原理 NASBA技術利用AMV逆轉錄酶、核糖核酸水解酶H、T7 RNA聚合酶三種酶在41 ℃恒溫環境下15～25 min，經過約20個擴增循環，便能實現對RNA模板的109倍擴增[1]。NASBA技術原理如圖1所示。如今，NASBA技術已經用于支原體、病毒、細菌等病原體和寄生蟲的檢測之中[2]。

圖1 NASBA原理圖

1.2擴增產物檢測方法 NASBA核酸擴增后的檢測手段眾多：電泳分析、化學發光、電化學發光法、酶聯免疫吸附試驗(MB)技術及其與CRISPR/Cas系統、數字化芯片、脫氧核酶、分裂探針等技術的聯合應用。

1.3NASBA技術特點 優點：(1)特異度高、靈敏度強檢測所需的RNA水平可低至aM水平。 (2)操作步驟簡易，可直接加入沒有經提取的RNA標本進行擴增；采用“一鍋法”擴增后可直接讀取結果。 (3)設備環境要求低不需要昂貴的PCR儀，只需要一臺恒溫設備，甚至只是一個水浴鍋。 (4)滿足世界衛生組織(WHO)的“ASSURED”要求[3]。

缺點：(1)假陽性問題，因非特異性擴增、NTPs等因素而造成假陽性問題。(2)涉及多種酶類，考慮核酸擴增環境對酶活性的影響因素眾多。(3)模板RNA易降解，需要加入RNA酶抑制劑保護模板及擴增產物。

2 NASBA的應用

2.1NASBA在植物疾病中的應用 早在1998年，MB與NASBA技術的結合運用就被LEONE等[4]提出并應用于馬鈴薯卷葉病毒的檢測中。加入限制性核酸內切酶和運用算法軟件，便能實現對肝炎病毒B型、皰疹病毒1型和2型進行定量檢測[5]。最近，HEO等[6]使用基于 MB的實時定量核酸依賴性擴增技術(qNASBA)檢測蘋果銹果類病毒RNA，表明qNASBA技術與建立的RT-PCR技術相比具有更高的靈敏度和特異度。

2.2NASBA在食品安全中的應用 NASBA技術在1995年已被運用在食物空腸彎曲菌的檢測之中[7]。ZHAI等[8]運用基因組學技術和NASBA篩選并檢測食物中丙型副傷寒沙門菌的特異性血清型標志物，成功地與傷寒沙門菌和甲型副沙門菌區別開來。ZHAI等[9]設計靶向xcd基因的qNASBA檢測48種沙門菌和18種非沙門菌，并于活細胞檢測背景進行檢測，如豬肉、牛頭和鮮奶等，同樣具有高特異度和達10 CFU/25(g·mL)的檢測限。

2.3NASBA在人類疾病中的應用 TENG等[10]通過固化于聚乙二醇的MB捕獲聚苯乙烯微球上的擴增核酸產物，應用于流行性感冒病毒A型、流行性感冒病毒B型和呼吸道合胞病毒的檢測而無交叉反應。RAMEZANI等[11]利用NASBA聯合ELISA快速檢測結核分枝桿菌EF-Tu mRNA。在4 h內，最低可以檢測到17.5 pg的RNA。對于臨床標本，其靈敏度和特異度可達97%和75%。LOENS等[12]對215個咽拭子標本進行衣原體、支原體的檢測，qNASBA的結果與qRT-PCR具有較高的一致性。HUANG等[13]對6篇利用NASBA技術檢測肺炎支原體的文獻進行薈萃分析，總體上發現NASBA技術檢測肺炎支原體的特異度和靈敏度分別為98%和77%，集成ROC曲線下面積達0.987 5，表明NASBA技術具有較高的診斷價值。已有多份臨床研究使用qNASBA檢測HPV、瘧原蟲的Pfs25 mRNA和瘧原蟲特異性18s rRNA，結果表明與RT-PCR具有較高的一致性[14-16]。

3 NASBA的改良研究

3.1對核酸擴增反應的改良

3.1.1對擴增效能的優化 傳統的NASBA技術依賴于T7 RNA聚合酶合成(-)RNA單鏈，是核酸擴增反應中的一大限速步驟。因此，2021年JU等[17]在傳統NASBA技術的基礎上加入切口核酸內切酶(NE)，稱為基于切口的指數型鏈式反應系統的核酸擴增(NESBA)。NESBA檢測的合成RNA濃度達1 aM至1 pM，20～30 min即達熒光閾值，檢測靈敏度要比傳統的NASBA技術高100倍且在檢測呼吸道合胞病毒和流感病毒等均未出現假陽性反應。JU等[18]利用NESBA技術30 min內完成檢測新型冠狀病毒包膜基因(E genes)和核衣殼蛋白基因(N genes)，以其超高的靈敏度可檢測低至每反應管10 copy，與RT-PCR相比達到100%特異度和100%靈敏度。

WANG等[19]研究HIV-1時聯合了MB和數字化芯片平臺技術，并對用于dLAMP和dRT-PCR的微流控芯片進行管道改進，稱為數字化核酸依賴性擴增技術(dNASBA)。dNASBA技術可檢測達1拷貝/微升的模板量，其靈敏度比普通qNASBA要高一個數量級，因其高特異性與靈敏度、低成本和高效而更加適用于即時診斷(POC)。

借鑒于巢式PCR，ABDOLAHZADEH等[20]首次設計巢式NASBA引物和加入可編碼RNA Mango 適配子序列的內向引物，構建巢式NASBA(NMN)檢測大腸桿菌ClpB基因，可使NASBA的LOD提高至1.5個RNA分子/微升，即aM水平。相比于沒有巢式引物的NASBA，其靈敏度提高了6個數量級。

3.1.2對非特異性擴增反應的優化 假陽性結果一直是NASBA應用的一大痛處。因此，AUFDEMBRINK等[21]用多色的、基于核酸適配子識別的熒光探針，獨創性地加入沒有靶基因片段、T7 RNA聚合酶啟動子序列和適配子編碼序列的40 bp干擾核苷酸片段，稱為Apta-NASBA，并用于檢測產毒素大腸桿菌estP和estH RNA，有效地抑制了傳統NASBA非特異性核酸擴增帶來的假陽性反應。

3.2對擴增產物檢測系統的改良

3.2.1探針的應用及優化 適配子(又稱適體)的強特異性和強親和力特性給予了分裂探針檢測擴增產物的應用基礎[22]。KIKUCHI等[23]首先利用dapoxyl DNA適配子(DAP-10)設計了一對分裂雜交寡核苷酸適配子探針(SDA)，檢測經過NASBA技術擴增寨卡病毒的Z-147基因，LOD值可達10 nM水平。

脫氧核酶(DNAzyme)是一段由脫氧核糖核酸構成的寡核苷酸鏈，其能形成一定的空間構象而發揮功能。DNAzyme的穩定性和其功能一定程度上給予了分裂探針的應用基礎。REED等[24]設計了基于磷酸二酯酶脫氧核酶的分裂探針(sDz)和加入酶底物顯色，將NASBA擴增后的寨卡病毒RNA結果可視化，且可于30 min內判斷結果，不與登革熱病毒和西尼羅病毒產生交叉反應，其最低可檢測到2.5 nM擴增產物或(0.4～8.0)×106copy/mL。DHAR等[25]利用基于磷酸二酯酶脫氧核酶的分裂探針(sDz)檢測結核分枝桿菌16s RNA，并成功地檢測到katG基因的單核苷酸突變，其LOD值達(1.5～13.0)nM。CONNELLY等[26]使用DAP-10-42設計一對分裂雜交寡核苷酸適配子探針，檢測耐異煙肼的、單核苷酸突變的結核分枝桿菌katG基因。相比于DAP-10，DAP-10-42可結合多種熒光染料，未來有望應用于多色比對檢測平臺中。應用免疫學方法半抗原標記探針，構建ELISA方法檢測NASBA產物。ASTATKE等[27]首先提出NASBA技術結合ELISA夾心法，加入半抗原標記DNA探針分別檢測埃博拉病毒L基因和登革熱病毒，同時表明地高辛(DIG)標記相比于異硫氰酸熒光素(FITC)標記的DNA探針具有更高的信噪比，其LOD值達到10拷貝數/反應管，達到qNASBA檢測限水平。

針對Taqman探針熒光基團和淬滅基團的分離與信號獲得，CRISPR/Cas系統也得以應用。XUE等[28]構建了基于CRISPR/Cas13“瘋切”作用的NASBA (cNASBA)技術檢測引起小鼠腸炎的沙門菌16s RNA，判斷沙門菌在腸道的分布及qPCR無法檢測的活菌數目。

3.2.2核糖開關的應用及改良 生物核糖開關最開始發現于細菌的基因表達調控機制中，如今逐漸應用為基因表達檢測系統[29]。CAO等[30]利用基于RNA的生物核糖開關調節β-半乳糖苷酶的表達，以酶底物顯色經NASBA擴增后呼吸道合胞病毒A型和B型，最低可檢測91 aM的擴增產物，并且與人類冠狀病毒HKU1和新冠病毒無交叉反應。WU等[31]在此基礎上使用免疫磁珠富集法和濾紙作為凍干劑與載體，可檢測低至270 zM諾如病毒的臨床標本。

3.2.3固相載體的應用及優化 此前，應用于NASBA的檢測系統多為液相之中，而應用固相中的檢測系統非常少，最常見的固相載體是橫向流動試紙條。最近，MA等[32]提出固相化核酸依賴性等溫擴增(SP-NASBA)技術概念，并應用于檢測金黃色葡萄球菌金黃色亞種(ATCC 12600) 的rRNA，驗證其特異度和靈敏度，同時針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌Sau3A-I基因，對其進行定量檢測。TAKAHASHI等[33]詳細描述了利用基于紙的無細胞檢測系統快速檢測人腸道菌標志物的方法。YRAD等[34]應用橫向流動(LF)試紙條檢測經NASBA擴增的登革熱病毒RNA，其最低判定值可達0.01 μM或1.2 × 104pfu/mL且不受寨卡病毒的干擾。

3.3對擴增副產物檢測系統的改良 核酸擴增的副產物有氫離子和無機焦磷酸兩種。

應用酸堿指示劑檢測反應溶液中的pH變化的檢測方法對溶液初始酸堿度有較嚴格的要求，且受限制的指示劑加入量又會降低溶液顏色變化的顯著程度，導致較高的假陰性率，方法的應用和改良空間有限[35]。

最近的研究則多數是針對無機焦磷酸副產物為切入點。ISOBE等[36]使用次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPT)、黃嘌呤氧化酶(XOD)和鐵測定Nitroso-PSAP法作為檢測系統檢測經NASBA擴增的人真皮成纖維母細胞β-actin RNA，其構建的檢測方法的 LOD和定量限( LOQ)遠低于NASBA所產生的焦磷酸濃度，證實了構建的方法的可行度、靈敏度和特異度。相比于已建立的、無酶的焦磷酸檢測試劑盒，此構建的基于HPT等酶的焦磷酸檢測方法不會出現因NTPs等因素影響而造成的假陽性結果，并且也可用于PCR的產物檢測。因ATP存在于各種組織中而不適用基于ATP的酶-底物顯色系統，KARASAWA等[37]利用丙酮酸磷酸雙激酶和丙酮酸脫氫酶構建化學發光焦磷酸鹽檢測系統，檢測經NASBA擴增的胰腺癌標志物MiR-196a。

4 總結與展望

核酸擴增技術尚存在許多問題亟待解決，如低拷貝分析物的分析靈敏度問題、反應體系酶類溫度控制問題等。其中，最突出的問題是假陽性擴增反應。對于NASBA的非特異性擴增反應，MU等[38]指出可能是因高濃度Mg2+誘導的T7 RNA聚合酶的自發性轉錄。AMV-RT通過蛋白質間相互作用抑制T7 RNA聚合酶活性的問題也有待解決。NASBA擴增產物檢測使用的核酸適配子探針相比于傳統的核苷酸探針具有更高的特異性和親和性，但目前的核酸適配子探針設計軟件(如G-Quadruplexes等)算法還有待改進，特別是對于環境離子變化所帶來的核酸結構改變的識別和預測仍需要提高[39]。

NASBA技術不僅繼承了PCR技術高靈敏度、高特異度的特點，而且具備實驗操作簡易、流程時長短、不需要特定儀器等特點，已報道應用于有害藻類的環境檢測中[40]。基于紙的無細胞檢測系統與NASBA的聯合運用則更加適用于地方性、偏遠地區醫療的即時診斷。從提出到如今，NASBA及其衍生技術不斷向著縮短擴增時間、提高特異度和靈敏度、簡化結果讀取等方向發展。基于多重微陣列技術的檢測、即時診斷、食物安全、環境檢測和單核苷酸突變分子診斷等領域更凸顯了NASBA技術與其他技術聯合應用的重要性，其在未來的研究與應用值得深究。