基于HIF-1α/ERK通路探討異丙酚對缺氧大鼠海馬神經元線粒體損傷的影響*

妙永惠，閻文軍

（1.臨夏州人民醫院 麻醉科，甘肅 臨夏 731100；2.甘肅省人民醫院 麻醉科，甘肅 蘭州 730000）

腦缺血性疾病屬于發病率、致死率和致殘率高的臨床常見疾病，嚴重威脅患者生命安全[1]。海馬神經元對缺氧反應十分敏感，線粒體損傷是神經元缺氧損傷的關鍵環節，探討海馬神經元缺氧損傷機制有重要的臨床意義[2]。近年來，麻醉藥的腦保護作用逐漸成為研究熱點。異丙酚對臟器保護及缺血再灌注損傷影響的研究已有報道[3-4]。既往研究顯示[5]，異丙酚具有減輕腦缺血再灌注損傷的保護作用，但其對線粒體損傷的影響及具體機制尚無定論。本研究通過體外培養大鼠原代海馬神經元，并應用糖氧剝奪法復制海馬神經元缺氧損傷模型，旨在觀察不同劑量異丙酚對缺氧海馬神經元線粒體損傷的作用，并探討其可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級新生SD 大鼠（24 h 內）2 只，性別不限，體重（8±2）g，健康（皮膚黏膜紅潤，運動正常），購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2018-005]。

1.2 主要試劑與儀器

異丙酚（英國阿斯利康制藥有限公司，批準文號：H20130535），缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）/細胞外調節激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）特異性抑制劑U0126（武漢艾美捷科技有限公司），DMEM-F12培養液、Neurobasal-A 培養液（美國HyClone 公司），多聚賴氨酸（美國Sigma 公司），鈣調神經磷酸酶（Calcineurin,GaN）檢測試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白濃度測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），鈣離子熒光探針（FLuo-AM）、聚乳酸聚合物（Pluronic F127）（海門市碧云天生物技術研究所），2，7-二氯熒光素二乙酸酯探針（2，7-Dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA）（北京百奧萊博科技有限公司），兔抗大鼠HIF-1α、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（cysteine-containing aspartate-specific proteases 3,Caspase-3）多抗（一抗）及辣根或氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 單抗（二抗）（美國Abcam 公司）。QP-80 型三氣培養箱（美國Thermo 公司），CKX53 型倒置光學顯微鏡、FV3000 型激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），Infinite F50 型酶標儀（瑞士TECAN 公司），Mini-PROTEAN Tetra 型電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 原代海馬神經元分離和培養 新生SD 大鼠斷頭處死，無菌取海馬組織，置于DMEM-F12 培養液（20%胎牛血清），更換0.25%胰蛋白酶消化處理25 min，吸管吹打均勻，加入DMEM-F12 培養液終止消化，消化液過200 目濾網，濾液經1 000 r/min 離心5 min，取沉淀，DMEM-F12 培養液重懸。調整細胞密度為5×105個/mL，培養于多聚賴氨酸包被的培養皿中，95% O2、5% CO2、37℃及飽和濕度條件下，培養24 h 后替換Neurabasal-A 培養液（2% B27+1% L-谷氨酰胺+1%丙酮酸鈉），倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，培養至第3 天加入4 mg/L 的阿糖胞苷抑制非神經細胞過度增殖，每3 天半量換液1 次，倒置顯微鏡觀察細胞形態，培養至第8 天采用免疫細胞化學染色法觀察神經元特異性烯醇化酶表達，細胞漿和突起棕褐色陽性染色細胞即為海馬神經元細胞，陽性細胞占總細胞數92%以上即可用于后續實驗[6]。

1.3.2 分組及干預方法 培養至第8 天原代海馬神經元細胞分為6 組，每組3 個復孔。對照組：用高糖DMEM 培養液替換Neurabasal-A 培養液；缺氧組：用低糖DMEM 培養液替換Neurabasal-A 培養液；低劑量異丙酚組（LP 組）、中劑量異丙酚組（MP 組）和高劑量異丙酚組（HP 組）：用含終濃度分別為3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L 異丙酚的低糖DMEM 培養液替換Neurabasal-A 培養液；U0126 組：用含終濃度12 mg/L異丙酚+50 μmol/L U0126 的低糖DMEM 培養液替換Neurabasal-A 培養液。對照組細胞于95% O2、5%CO2、37℃及飽和濕度條件培養24 h；缺氧組、LP 組、MP 組、HP 組和U0126 組細胞于95% N2、5% CO2、37℃及飽和濕度條件培養24 h。

1.3.3 透射電鏡觀察海馬神經元細胞形態 收集干預24 h 后的各組細胞，PBS 吹洗3 次后，加入胰蛋白酶消化獲得細胞沉淀，加入20 倍沉淀體積的固定液于4℃固定48 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次后，參照文獻[7]制作厚度為50 nm 超薄切片，經醋酸雙氧鈾雙面染色后，于透射電鏡下觀察細胞超微結構，并拍攝照片。

1.3.4 MTT 法檢測細胞存活率 收集干預24 h 后的各組細胞，分別加入0.5 g/L MTT溶液，繼續培養3 h，加入20%的十二烷基磺酸鈉溶液，充分混勻溶解結晶，應用酶標儀測定490 nm 波長處的吸光度值。計算細胞存活率=各干預組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡檢測Ca2+、活性氧（ROS）的熒光強度 原代海馬神經元細胞培養于加有載玻片的24 孔板，按照上述缺氧和干預方法處理24 h，Hank's 液洗滌3 次。每孔加入5 μmol/L FLuo-AM 和質量濃度0.05% Pluronic F127 混合液（Ca2+熒光強度檢測），或每孔加入10 μmol/L DCFH-DA 探針（ROS熒光強度檢測）。37℃避光孵育30 min，Hank's 液洗滌3 次，并用Hank's 液繼續避光孵育30 min，然后用4%多聚甲醛固定、封片，激光共聚焦顯微鏡（激發波488 nm、發射波525 nm）觀察拍照，應用Image J 圖像分析軟件分析熒光強度。

1.3.6 酶聯免疫吸附試驗檢測細胞GaN 活性 收集干預24 h 后的各組細胞，PBS 洗滌并重懸細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解20 min，12 000 r/min 離心15 min（離心半徑12 cm），取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度，按照GaN 檢測試劑盒說明書步驟操作，檢測細胞GaN 活性。

1.3.7 Western blotting檢測細胞的HIF-1α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量 收集干預24 h 后的各組細胞，PBS 洗滌并重懸細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解20 min，12 000 r/min 離心15 min（離心半徑12 cm），取上清液，于沸水水浴10 min 變性，再次離心取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度。取50 μg 待測蛋白進行恒定電流的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳約1.5 h，分離膠電轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋一抗HIF-1α（1∶400）、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3（1∶500），4℃過夜，含Tris-Hcl 的吐溫20 緩沖液（TBST）洗滌3 次，每次10 min，加入稀釋二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 再次洗滌，加入電化學發光液顯色，以β-actin為內參，蛋白條帶應用Image J 圖像分析軟件分析目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法

數據處理采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組海馬神經元形態改變

對照組線粒體膜和嵴結構完整清晰，數量多；缺氧組線粒體數量少且腫脹，嵴完整性和連續性破壞，空泡化嚴重；LP 組、MP 組和HP 組線粒體上述損傷均有所減輕，其中HP 組減輕最為明顯；U0126 組線粒體損傷較HP 組嚴重。見圖1。

圖1 各組海馬神經元線粒體超微結構（透射電鏡×15 000）

2.2 各組海馬神經元細胞存活率的比較

各組海馬神經元細胞存活率分別為：對照組（95.65±4.20）%、缺氧組（42.30±3.64）%、LP 組（45.41±4.22）%、MP 組（59.54±5.19）%、HP 組（70.81±6.47）%、U0126 組（53.08±5.61）%，各組比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=174.790，P=0.000）；進一步兩兩比較，結果：與對照組比較，缺氧組海馬神經元細胞存活率降低（P＜0.05）；與缺氧組比較，MP 組、HP 組及U0126 組海馬神經元細胞存活率升高，且HP 組高于MP 組和U0126 組（P＜0.05）；缺氧組與LP 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組海馬神經元Ca2+、ROS熒光強度的比較

各組海馬神經元Ca2+、ROS 熒光強度比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=155.230 和224.164，均P=0.000）；進一步兩兩比較，與對照組比較，缺氧組海馬神經元Ca2+、ROS 熒光強度均升高（P＜0.05）；與缺氧組比較，LP 組ROS 熒光強度降低（P＜0.05），Ca2+熒光強度差異無統計學意義（P＞0.05）；與缺氧組比較，MP 組、HP 組及U0126 組海馬神經元Ca2+、ROS 熒光強度均降低，且HP 組低于MP 組和U0126 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組海馬神經元細胞Ca2+、ROS熒光強度的比較（±s）

表1 各組海馬神經元細胞Ca2+、ROS熒光強度的比較（±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與缺氧組比較，P ＜0.05；③與LP 組比較，P ＜0.05；④與MP 組比較，P ＜0.05；⑤與HP 組比較，P ＜0.05。

2.4 各組海馬神經元細胞GaN活性的比較

各組海馬神經元細胞GaN 活性分別為：對照組（0.23±0.02）u/mg、缺氧組（0.61±0.05）u/mg、LP 組（0.59±0.06）u/mg、MP 組（0.50±0.05）u/mg、HP 組（0.37±0.04）u/mg、U0126 組（0.54±0.04）u/mg，各組海馬神經元細胞GaN 活性比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=123.120，P=0.000）；進一步兩兩比較，與對照組比較，缺氧組海馬神經元GaN 活性升高（P＜0.05）；與缺氧組比較，MP 組、HP 組及U0126 組海馬神經元GaN 活性降低，且HP 組低于MP 組和U0126 組（P＜0.05）；缺氧組與LP 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 各組海馬神經元細胞HIF-1 α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量比較

各組海馬神經元細胞HIF-1α、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），各組ERK1/2 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）；進一步兩兩比較，與對照組比較，缺氧組HIF-1α、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與缺氧組比較，LP 組、MP 組、HP 組及U0126 組HIF-1α、p-ERK1/2 蛋白相對表達量升高，且HP 組高于LP 組、MP 組和U0126 組（P＜0.05）；與缺氧組比較，LP 組、MP 組、HP 組 及U0126 組Caspase-3 蛋白相對表達量降低，且HP 組低于LP組、MP 組和U0126 組（P＜0.05）；缺氧組與LP 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2 和表2。

圖2 各組海馬神經元細胞HIF-1α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3蛋白表達

表2 各組海馬神經元細胞HIF-1α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3蛋白相對表達量的比較（±s）

表2 各組海馬神經元細胞HIF-1α、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3蛋白相對表達量的比較（±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與缺氧組比較，P ＜0.05；③與LP 組比較，P ＜0.05；④與MP 組比較，P ＜0.05；⑤與HP 組比較，P ＜0.05。

3 討論

腦組織對缺氧十分敏感，尤其是海馬神經元，短時間的缺氧即可造成不可逆損傷，其機制十分復雜，目前仍未完全闡明[8-9]。研究認為，氧化應激、胞內鈣超載是神經元缺氧損傷的重要機制，腦組織缺氧后，突觸過度激活引起Ga2+通道開放，細胞外Ga2+大量內流，同時自由基大量生成，導致線粒體膜去極化發生結構改變[10]。進一步促使Ga2+通道開放，胞內鈣超載，加重神經元損傷。胞內鈣超載導致的線粒體損傷可加速神經元凋亡，目前該機制已成為研究的熱點領域[11-13]。目前關于異丙酚對缺氧海馬神經元線粒體損傷的影響及具體機制仍需深入研究，為其臨床應用提供理論支持。

本研究結果顯示，缺氧組海馬神經元存活率低于對照組，細胞內線粒體超微結構損傷嚴重，Ca2+、ROS 熒光強度、GaN 活性高于對照組，說明缺氧可導致細胞外Ga2+大量內流，造成海馬神經元線粒體損傷，最終引起海馬神經元死亡。本研究進一步應用不同濃度異丙酚作用于體外培養海馬神經元，結果發現，MP 組、HP 組線粒體損傷減輕，且細胞存活率高于缺氧組，Ca2+、ROS 熒光強度、GaN 活性均低于缺氧組，提示異丙酚具有減少海馬神經元鈣超載，清除自由基，緩解胞內線粒體損傷的作用。研究表明，異丙酚可激活γ-氨基丁酸A 型（GABAA）受體，可以選擇性地讓Cl-通過，引起細胞膜超極化，Ga2+內流[14]。另有研究表明，異丙酚可通過抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體毒性，變構調節門控通道，發揮細胞保護作用[15]。動物實驗研究顯示[16]，丙泊酚可有效緩解七氟烷誘導的大鼠海馬神經細胞損傷，抑制炎癥反應和神經元凋亡，從而發揮認知損傷保護作用。XU 等[17]的研究顯示，低濃度丙泊酚可增強海馬神經元活力，抑制其凋亡，與本研究結果相似，但在其研究中高濃度丙泊酚可降低海馬神經元活力，促進其凋亡，可能與p38 絲裂原活化蛋白激酶磷酸化水平有關，這與本研究結果不一致，其原因可能為本研究選用的細胞糖氧剝奪模型而使研究結果差異。

本研究發現，缺氧組HIF-1α、p-ERK1/2、Caspase-3 蛋白相對表達量均高于對照組，不同濃度異丙酚干預后上述蛋白表達量降低，提示丙泊酚抑制細胞內線粒體損傷的作用可能與抑制HIF-1α/ERK 信號通路激活有關。HIF-1α/ERK 是細胞缺氧損傷相關的關鍵信號通路之一。HIF-1α 屬于細胞內具有轉錄活性的核蛋白，缺氧條件下大量表達調控多種基因轉錄和翻譯，以適應缺氧環境[18]。ERK1/2 磷酸化水平與缺氧及細胞凋亡關系密切，可直接影響HIF-1α 轉錄活性，同時可調控下游凋亡關鍵蛋白酶Caspase-3 的表達[19-20]。本研究在高劑量異丙酚基礎上應用HIF-1α/ERK 信號通路抑制劑U0126 干預，結果顯示，與HP 組比較，U0126 組線粒體損傷程度較重，細胞存活率降低，Ca2+、ROS熒光強度及GaN 活性升高，且HIF-1α、p-ERK1/2 蛋白相對表達量降低，Caspase-3 蛋白表達量升高，進一步說明異丙酚可通過激活HIF-1α/ERK 信號通路發揮減輕大鼠海馬神經元線粒體損傷的作用。

綜上所述，不同濃度異丙酚作用于體外培養海馬神經元可減少細胞內Ca2+、ROS 熒光強度，抑制GaN 活性，減輕缺氧大鼠海馬神經元線粒體損傷，其調控機制可能與HIF-1α/ERK 信號通路有關。海馬神經元糖氧剝奪損傷是多種分子機制共同作用的結果，線粒體損傷導致的能量代謝異常是導致細胞凋亡的主要原因之一，其機制也存在復雜性。本研究僅從HIF-1α/ERK 信號通路分析了異丙酚對線粒體損傷影響的機制，后續研究重點將探討異丙酚能否通過其他途徑影響神經元線粒體損傷，為臨床提供更多的理論依據。