積雪草苷通過Nrf2/HO-1 信號通路對創傷膿毒血癥大鼠腎損傷的保護作用研究

朱恒杰，曾允富*，程少文，鄭林洋

海南醫學院第一附屬醫院急診和創傷外科，海南 海口 400000

膿毒血癥是一種影響全身的炎癥反應綜合征，可由感染、創傷等原因導致，臨床上屬于危重癥，死亡率極高[1]。 膿毒血癥容易導致多組織、多器官的損傷，其中腎臟是最常見的受損器官，若不及時進行有效處理，疾病極易通過腎損傷發展為多器官衰竭，進而導致患者死亡[2]。 故本文以腎臟為膿毒血癥疾病進展的代表進行研究。 在膿毒血癥疾病進展的復雜病理機制中，氧化應激系統過度反應而平衡失調是膿毒血癥致腎損傷的重要原因。 大量活性氧因子可通過氧化反應引發機體嚴重的應激損傷，造成腎小球腎小管等組織壞死，腎功能急劇下降。 因此，許多學者認為，調控并延緩生物體內的氧化應激反應，有望成為治療膿毒血癥腎損傷的關鍵環節[3-4]。

傘形科植物積雪草[Centella asiatica （L.） Urban]是一種源于中國廣西的壯族醫藥，具有消腫、促進循環和利尿等功效[5]。三萜皂苷積雪草苷（asiaticoside,AS）是從積雪草中分離的一種天然化合物，在體外細胞培養和活體動物模型等實驗中顯示出廣泛的生物活性，目前已經證實其具有抗氧化、抗炎、抗病毒、促進傷口愈合等多種藥理作用[6-8]。 研究發現，AS可以通過降低小鼠腎組織中的誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）蛋白表達與血清中白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）的含量，減輕炎癥反應，改善膿毒血癥導致的急性腎損傷[9]。然而AS 是否能通過調控氧化應激反應從而對膿毒血癥腎損傷發揮治療作用，目前還未見報道。

血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1, HO-1）是一種可以催化機體生產抗氧化劑的酶。 核因子E2 相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）作為一種主要的轉錄因子，可以激活HO-1 等下游抗氧化應激因子的表達，調節細胞對氧化應激的反應[10-11]。朱時玉等[12]通過建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型，證實AS 能夠減少大鼠腎組織氧化應激水平，對腎損傷有保護作用，其機制與激活Nrf2/HO-1通路相關。 據此，本研究探討AS 是否可通過Nrf2/HO-1 通路影響膿毒血癥氧化應激反應，觀察膿毒血癥大鼠接受不同濃度AS 干預后，腎臟的功能與氧化應激水平的變化，以期進一步闡明AS 在膿毒血癥治療中發揮的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60 只雄性SPF 級SD 大鼠購自上海Sippr BK動物實驗室，動物合格證號：SCXK（京）2021-0002，安置在屏障環境中（溫度為20～25 ℃，濕度為50%～65%，光照12 h/d），以標準飼料喂養至10周齡，體質量(220±30) g。 本實驗符合動物實驗倫理要求，倫理審批號為：PZ-HNSZYY-2021-015。

1.2 主要試劑與儀器

AS （上海現代制藥股份有限公司，批號：CY16830）；氨芐西林鈉（國藥集團威奇達藥業有限公司，批號：ZY0769）；丙二醛（malonic dialdehyde, MDA）檢測試劑盒（批號：S0131）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）檢測試劑盒（批號：S0109）、RIPA裂解液（批號：R0010）、BCA 試劑盒（批號：R00011）、HE 染色試劑盒（批號：R01007）均購于上海碧云天生物技術有限公司；GAPDH（批號：5511）、Nrf2（批號：7023）、HO-1（批號：2897）均購自美國Cell Signal公司。

全自動生化分析儀（瑞士Roche 公司，型號：Cobas Integra 800）；自動酶標儀（美國Biotek Winooski 公司，型號：Bio-tekELX800）；蛋白電泳儀（型號：1659001）、半干轉膜儀（型號：Trans-Blot SD）、Western blot 成像系統（型號：GS-900）均購于美國Bio-Rad 公司；低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司，型號：Centrifuge 5424R）；輪轉切片機（型號：RM2035）、烤片機（型號：HI1220）均購于德國Leica 公司；生物顯微鏡（日本Nikon 公司，型號：EclipseE200）。

1.3 動物分組及建模

將所有大鼠標號，隨機分為對照組（n=10）和膿毒血癥組（n=50）。 膿毒血癥組大鼠采用盲腸結扎法建立疾病模型：麻醉后以仰臥位固定大鼠于手術臺上，消毒，沿中線剪開腹腔，取出盲腸，1 號線結扎，16 號線穿刺針刺穿盲腸，溢出少量糞便后，將盲腸還納腹腔，縫合。 術后若大鼠蘇醒時間較對照組明顯延長，精神萎靡，活動與飲食減少，則認為建模成功[13]。對照組手術中無結扎和刺穿盲腸步驟。將膿毒血癥組隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性組，每組10 只大鼠。 手術后12 h，若大鼠蘇醒則開始灌胃給藥。 以ZHU 等[14]在用AS 治療糖尿病腎病大鼠模型中采用的劑量作為參考，將AS溶于生理鹽水配制為1.0、2.5、5.0 mg/mL 的藥液，分別給予低劑量組、中劑量組、高劑量組灌胃，對照組和模型組采用生理鹽水灌胃，灌胃劑量均為10 mL/kg，陽性組腹腔注射氨芐西林鈉200 mg/kg。

手術72 h 后，處置大鼠提取標本。 若有提前死亡大鼠，記錄其生存時間并取樣用于后續檢測。

1.4 標本收集

硫噴妥鈉40 mg/kg 靜脈注射處死大鼠。從腹主動脈抽血于抗凝管中，3000 r/min，4 ℃離心15 min（離心半徑40 cm）制備血清，分裝標記后儲存在-80 ℃冰箱備用。 取部分新鮮腎組織，用生理鹽水清洗，部分用4%多聚甲醛固定，脫水、透明后石蠟包埋，制成3 μm 厚連續切片備用。 其余腎組織剪碎后置于蛋白裂解液中制備為勻漿液，3000 r/min，4 ℃離心20 min（離心半徑40 cm），收集上清，BCA 法提取總蛋白質并測定蛋白質含量，分裝標記后儲存在-80 ℃冰箱備用。

1.5 腎臟病理形態觀察

3 μm 厚連續切片經過脫蠟、脫二甲苯處理，蘇木精染色2～3 min，鹽酸乙醇分化15 s，伊紅染色1 min，梯度脫水、透明后中性樹膠封片。 在光學顯微鏡下觀察腎臟的組織形態和病理變化。

1.6 Scr、BUN、MDA、SOD 水平測定

全自動生化分析儀檢測血清中血肌酣（serum creatinine, Scr）和尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）含量水平。 根據ELISA 試劑盒說明檢測MDA 和SOD值。

1.7 Nrf2、HO-1 蛋白表達水平測定

采用Western bolt 法檢測Nrf2、HO-1 蛋白表達水平。 解凍前期收集蛋白樣品，制備SDS-PAGE 凝膠。 將含有100 μg 蛋白質的樣品加入凝膠孔，電泳、轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉4 h，TBST洗滌。 加入Nrf2、HO-1 一抗（均以1∶100 稀釋），4 ℃下孵育過夜。 TBST 洗滌后，將膜放入山羊抗小鼠二抗（以1∶1000 稀釋）中孵育1 h，TBST 清洗。 ECL顯影，Western blot 成像系統掃描拍攝，ImageJ 軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.8 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。 所有變量均為連續型變量，以“±s”表示。 根據樣本量、數據是否正態分布、方差是否齊選取統計方法。 Kruskal-Wallis 檢驗用于分析整體差異，組間比較采用LSD-t檢驗。 P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AS 對膿毒血癥大鼠生存狀況的影響

對照組無大鼠死亡，平均生存時間為72 h。 與對照組比較，模型組、低劑量組大鼠平均生存時間減少（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性組大鼠平均生存時間增加（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組及陽性組大鼠平均生存時間增加（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組及陽性組大鼠平均生存時間增加（P＜0.05）；高劑量組及陽性組大鼠平均生存時間差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠平均生存時間比較

2.2 AS 對膿毒血癥大鼠腎臟病理形態的影響

光鏡下可見對照組大鼠腎組織未見明顯異常。模型組則出現明顯的炎癥反應，包括炎癥細胞在腎組織中大量浸潤，腎間質充血水腫，腎小管擴張，腎小球球囊黏連、系膜增生，表明模型建立成功。 而在AS 治療各組中，腎組織炎癥反應較模型組均明顯減輕，并呈現劑量依賴性，高劑量組與陽性組組織形態趨于正常。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理變化（HE，×200）

2.3 AS 對膿毒血癥大鼠腎功能指標的影響

與對照組比較，模型組Scr 和BUN 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性組Scr 和BUN 水平均明顯下降（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組及陽性組Scr和BUN 水平均明顯下降（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組及陽性組Scr、陽性組BUN 水平降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性組BUN 水平升高（P＜0.05）。 詳見圖3。

圖3 各組大鼠Scr、BUN 水平比較

2.4 AS 對膿毒血癥大鼠氧化應激指標的影響

與對照組比較，模型組大鼠MDA 水平升高、SOD 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性組MDA 水平降低、SOD水平升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組及陽性組MDA 水平降低、SOD 水平升高（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組及陽性組MDA 水平降低、SOD 水平升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性組MDA 水平升高（P＜0.05）。 詳見圖4。

圖4 各組大鼠MDA、SOD 水平比較

2.5 AS 對膿毒血癥大鼠Nrf2、HO-1 蛋白表達水平的影響

與對照組比較，模型組Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性組Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組及陽性組Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組及陽性組Nrf2 和HO-1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性組HO-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。 詳見圖5。

圖5 各組大鼠Nrf2 和HO-1 蛋白相對灰度值的比較

3 討論

AS 作為傳統中藥的提純物，在動物實驗中表現出對膿毒血癥的緩解作用[9]，然而其具體藥理機制尚未明確。 本文通過盲腸結扎法建立膿毒癥大鼠模型，結果顯示，與對照組比較，模型組生存時間更短，腎組織炎癥反應明顯，腎功能下降，氧化應激水平升高，表明模型建立成功。 AS 在中醫中被用于治療腎臟疾病，多項研究證實了AS 具有腎臟保護作用[9，12，15]。本文結果顯示，經AS 治療后，膿毒血癥大鼠的生存時間延長，HE 染色可見腎組織炎癥反應減輕，Scr和BUN 水平均下降。上述結果表明腎功能以及疾病整體狀況得到了改善，AS 可以保護膿毒血癥大鼠腎功能，然而目前對于AS 治療腎臟疾病的機制仍不明確。

本研究選取了MDA 和SOD 作為氧化應激水平的衡量標志。MDA 屬于脂質過氧化反應的終末產物之一，是體內重要的氧化應激監控指標，其含量與機體內氧化應激嚴重程度呈正相關[16]。 SOD 是一種具有抗氧化功能的金屬酶，可催化超氧化物陰離子的歧化反應，抑制氧化應激損傷[17]。 本研究中，AS 治療各組與模型組相比，MDA 水平明顯下降，而SOD 水平上升，說明AS 具有抑制大鼠氧化應激反應的作用。

進一步研究機制發現，模型組大鼠Nrf2 與HO-1蛋白表達水平均較對照組更低，而AS 治療可逆轉此降低趨勢，升高Nrf2 與HO-1 蛋白表達水平。 這可能是AS 抑制氧化應激反應的機制。Nrf2/HO-1 通路是體內重要的抗氧化應激通路，Nrf2 激活后，誘導HO-1 產生，催化血紅素降解成一氧化碳和亞鐵，后者具有抗氧化、抗炎作用，可抑制和拮抗氧化應激反應。 另外，Nrf2 還可以增加SOD 等抗氧化劑的表達，減輕機體氧化反應[10-11]。 在多種腎臟損傷模型中，通過激活Nrf2/HO-1 通路抑制氧化應激反應均取得了一定的治療效果[18-20]。 在小鼠的腎缺血再灌注損傷模型中，茯苓酸可降低MDA 和環氧合酶2的水平，增加谷胱甘肽等一系列抗氧化因子的表達，發揮腎損傷保護作用，其原理被認為和直接或間接激活Nrf2，上調下游GPX4、SLC7A11 和HO-1 的表達有關[18]。劉華[19]、王文文[20]等也利用不同的藥物干預缺血再灌注腎損傷模型，證明藥物可通過Nrf2/HO-1通路緩解氧化應激反應，改善缺血再灌注造成的腎損傷。 此外，在葉酸誘導的腎損傷模型[21]、草酸鈣腎結石模型中[22]，Nrf2/HO-1 的激活可以有效降低機體內的氧化應激指標含量。與本研究膿毒血癥模型中，AS 通過Nrf2/HO-1 抑制氧化應激反應相互印證。

本研究結果顯示，不同濃度AS 的療效呈現劑量依賴性，其中，高劑量組與模型組對比療效最為明顯。 此外，高劑量組大鼠BUN 和MDA 水平較陽性組更低，HO-1 蛋白表達水平較陽性組更高，其余指標與陽性組相比差異無統計學意義。 表明AS 對腎臟的保護作用與氧化應激反應的抑制作用隨劑量升高而增強，且較抗生素治療有一定的優勢。

綜上所述，AS 可能通過Nrf2/HO-1 通路，抑制氧化應激反應，改善膿毒血癥大鼠的癥狀，延緩疾病進展，其作用呈現劑量依賴性，可能的機制與AS 上調Nrf2/HO-1 通路有關。