DBD 等離子體滅活水中的金黃色葡萄球菌生物膜研究

唐燕丹 許子牧

（合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

1 引言

水的衛(wèi)生安全直接關(guān)系到人體健康［1］，飲用水分配系統(tǒng)（DWDS）在飲用水行業(yè)中發(fā)揮著重要的傳遞作用。然而各種病原微生物通過(guò)形成穩(wěn)定的生物膜可以牢固地附著在DWDS 中，其不但分泌有機(jī)質(zhì)腐蝕管道、污染水質(zhì)，而且解體后通過(guò)流動(dòng)水體不斷傳播影響千家萬(wàn)戶，從而導(dǎo)致潛在的疾病感染［2］。另外，生物膜相對(duì)單一懸浮細(xì)菌呈現(xiàn)出更復(fù)雜的特性，其往往是多種細(xì)菌混雜在一起，其相比懸浮細(xì)菌更難滅活和根除。因此，對(duì)DWDS 中致病微生物膜的處理顯得尤為重要［3］。傳統(tǒng)的滅菌方法在水質(zhì)復(fù)雜、污染物種類多的情況下有一定的局限性，對(duì)環(huán)境和公共衛(wèi)生等會(huì)產(chǎn)生不利影響。因此，找到一種高效滅活細(xì)菌生物膜的方法，對(duì)DWDS 凈化消毒具有重要意義。

低溫等離子體作為高級(jí)氧化技術(shù)（AOPs）的一種，在有機(jī)物降解和細(xì)菌滅活方面引起了廣泛關(guān)注［4］。等離子體放電可產(chǎn)生自由基等活性組分，這些物質(zhì)直接與致病微生物發(fā)生反應(yīng)，快速滅活，且不會(huì)產(chǎn)生有毒有害的副產(chǎn)品［5-6］，因此等離子體在滅活致病微生物方面具有很大的潛力。

金黃色葡萄球菌（S.aureus）生物膜是革蘭氏陽(yáng)性病原菌中最常見(jiàn)的自然存在形式之一，易在自來(lái)水運(yùn)輸管道中形成并污染水源［7-8］。本研究以S.aureus生物膜為研究對(duì)象，研究DBD 等離子體對(duì)S.aureus生物膜的滅活效果，以期為DBD 等離子體應(yīng)用于真實(shí)水體中滅活S.aureus 生物膜提供參考。

2 材料和方法

2.1 試劑和儀器

菌株和試劑：S.aureus 為安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院贈(zèng)予；LB 肉湯；刃天青（Resazurin）染料（Sigma，USA）；胞內(nèi)活性氧檢測(cè)試劑盒（Beyotime，China）。

儀器：高壓電源；酶標(biāo)儀（Thermo－Fisher Scientific，USA）；純水機(jī)；振蕩器；電熱恒溫培養(yǎng)箱；PhotoLab6100分光光度計(jì)。

2.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)時(shí)將制備好的生物膜置于圖1 所示的DBD等離子體裝置底部，當(dāng)DBD 等離子體放電產(chǎn)生的活性物質(zhì)通過(guò)底部的小孔以氣泡的形式在溶液中擴(kuò)散，S.aureus 生物膜會(huì)與溶液中活性物質(zhì)反應(yīng)。

圖1 DBD 等離子體裝置

2.3 分析方法

2.3.1 放電電流與電壓檢測(cè)

使用示波器測(cè)量DBD 等離子體放電電流、電壓，功率計(jì)算公式如下［9］：

式中，P 代表放電功率，W；T 代表放電周期，s；U 代表放電電壓，V；I 代表放電電流，A；f 代表放電頻率，Hz；C 代表電容，F(xiàn)；S 代表李薩如圖形面積。

2.3.2 長(zhǎng)壽命活性物質(zhì)檢測(cè)

過(guò)氧化氫（H2O2）濃度采用H2O2含量檢測(cè)試劑盒（AKAO009C，Beijing Boxbio Science＆Technology Co.，Ltd，China）通過(guò)分光光度法測(cè)定。NO3－和NO2－濃度采用檢測(cè)試劑盒（MERCK，09713，00609，Germany）通過(guò)分光光度計(jì)（photolab 7100，WTW，Germany）測(cè)定。

2.3.3 DBD 等離子體滅活生物膜

將長(zhǎng)滿S.aureus 生物膜的細(xì)胞爬片放入DBD等離子體射流反應(yīng)器底部，放電處理后提取出細(xì)胞爬片，并放入含有2 mL 無(wú)菌水的離心管中。用無(wú)菌平端刮刀刮除菌體表面的生物膜放進(jìn)離心管里。離心管隨后被浸入45 kHz 超聲波中水浴3 min，然后10 s 渦旋，以確保完全取下生物膜，不會(huì)影響細(xì)胞活力。將菌懸液梯度稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用LB 固體培養(yǎng)基進(jìn)行生物膜的細(xì)菌計(jì)數(shù)，1 式3 份。在37 ℃下孵育過(guò)夜，形成菌落單位（CFU）。

2.3.4 新陳代謝能力檢測(cè)

使用Resazurin 的體外毒理學(xué)檢測(cè)試劑盒（Sigma－Aldrich，USA）來(lái)測(cè)量S.aureus 的代謝能力。取100 μL等離子體處理或未處理的S.aureus 懸浮液（作空白對(duì)照）分別移入96 孔板（1 個(gè)樣品/孔），將2.3.3 中取下的生物膜懸液移入96 孔板（1 個(gè)樣品/孔），并在每孔中加入100 μL 的Resazurin 染料溶液（10%）。100 μL 無(wú)菌水加入100 μL 的Resazurin 染料溶液（10%）為陰性對(duì)照。在37 ℃的黑暗環(huán)境下，將孔板孵化3 h。用Varioskan Flash 標(biāo)準(zhǔn)微板閱讀器（Thermo－Fisher Scientific，USA）在560/590 nm 的波長(zhǎng)下檢測(cè)每個(gè)樣品懸浮液的熒光強(qiáng)度。用無(wú)菌水加Resazurin作為對(duì)照。

2.3.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧

在本實(shí)驗(yàn)中，使用熒光探針2′，7′－二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH－DA）來(lái)檢測(cè)活性氧的含量。將按要求稀釋后的試劑和待測(cè)菌液各取1 mL 并混勻后于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置25 min，然后置于酶標(biāo)儀（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/525 nm）檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 放電特性

S.aureus 生物膜的滅活效率與DBD 等離子體的放電電壓以及功率有密切關(guān)系。圖2 為DBD 等離子體在放電時(shí)測(cè)得的電流電壓波形圖。從圖2 中可看出，峰值電壓和電流分別達(dá)到了9 kV 和0.18 A。

圖2 DBD 等離子體產(chǎn)生時(shí)的電流電壓波形圖

DBD 等離子體產(chǎn)生時(shí)的李薩如圖形見(jiàn)圖3。

圖3 DBD 等離子體產(chǎn)生時(shí)的李薩如圖形

由圖3 可見(jiàn)，李薩如圖形出現(xiàn)了許多不規(guī)律的毛刺，這主要是因?yàn)橛糜诜烹姷碾妷菏莻€(gè)定值，DBD放電又是暴露于空氣中放電，放電時(shí)不可避免地會(huì)因?yàn)闅饬鞯牧鲃?dòng)以及氣液面的輕微抖動(dòng)，使得放電過(guò)程不是完全穩(wěn)定。因此，李薩如圖形曲線不光滑。由這個(gè)李薩如圖形可求出等離子體放電產(chǎn)生的功率為47.2 W。

3.2 活性組分含量

等離子體放電會(huì)產(chǎn)生很多活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)很可能是等離子體能夠滅活細(xì)菌的原因。這些活性物質(zhì)產(chǎn)生的反應(yīng)式如下［10-12］（“*”代表水分子帶一個(gè)正電荷）：

H2O+e-→H2O*+2e-

H2O+H2O*→H2O-+·OH

2·OH→H2O2

N2+e-→2N·+e-

N·+O·→NO·

NO·+O·→NO2·+e-

NO2·+·OH→HNO3

NO·+·OH→HNO2

本研究對(duì)DBD 等離子放電過(guò)程中產(chǎn)生的長(zhǎng)壽命活性物質(zhì)H2O2，NO3－，NO2－的濃度進(jìn)行了檢測(cè)。圖4反映了DBD 等離子體對(duì)純水放電時(shí)，DBD 產(chǎn)生并溶于水中的H2O2，NO3－，NO2－，其濃度隨放電時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，24 min 時(shí)其濃度分別達(dá)到了0.94，8.23，22.32 mg/L。

圖4 H2O2，NO2－和NO3－含量隨DBD 等離子體處理時(shí)間的變化情況

3.3 滅活生物膜

采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)DBD 等離子體滅活S.aureus 生物膜的效果。DBD 等離子體處理S.aureus生物膜后細(xì)菌存活情況見(jiàn)圖5。

圖5 DBD 等離子體處理S.aureus 生物膜后細(xì)菌存活情況

由圖5 可知，隨著等離子體放電時(shí)間延長(zhǎng)，生物膜中存活的細(xì)菌數(shù)量逐漸降低。當(dāng)?shù)入x子體處理12.0 min 時(shí)，生物膜中存活的細(xì)菌數(shù)量下降了大約1.0個(gè)數(shù)量級(jí)。而當(dāng)?shù)入x子體處理時(shí)間延長(zhǎng)到24.0 min時(shí)，大約有3.2 個(gè)數(shù)量級(jí)的細(xì)菌被滅活。Xu 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，活化水滅活生物膜的效率隨著活化水浸泡時(shí)間的增加而增加，用等離子體放電0.5 h 產(chǎn)生的活化水浸泡S.aureus 生物膜0.5 h 后，使S.aureus 生物膜細(xì)菌降低了2.2 個(gè)數(shù)量級(jí)。本實(shí)驗(yàn)滅菌效果較好，可能是由于DBD 等離子體直接處理水溶液中的生物膜，放電產(chǎn)生的長(zhǎng)壽命物質(zhì)于胞內(nèi)活性物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

3.4 新陳代謝能力

DBD 等離子體處理后具有新陳代謝能力細(xì)菌所占百分比見(jiàn)圖6。

圖6 DBD 等離子體處理后具有新陳代謝能力細(xì)菌所占百分比

如圖6 所示，隨著DBD 等離子體處理時(shí)間的延長(zhǎng)，將會(huì)導(dǎo)致生物膜內(nèi)具有新陳代謝能力的細(xì)菌比例逐漸下降，與生物量和細(xì)菌數(shù)的變化一致，即生物膜形成能力弱、細(xì)菌數(shù)較少的代謝能力也相對(duì)較弱，表明DBD 等離子體射流在滅活生物膜的同時(shí)，對(duì)細(xì)菌代謝也有一定的抑制作用。同時(shí)，由于微生物新陳代謝等活動(dòng)與相關(guān)酶的作用密切相關(guān)，等離子體放電產(chǎn)生的活性物質(zhì)可能會(huì)影響酶的活性，從而導(dǎo)致其代謝能力下降。

3.5 胞內(nèi)活性物質(zhì)（ROS）含量

DBD 等離子體處理S.aureus 生物膜后胞內(nèi)ROS含量變化見(jiàn)圖7。

圖7 DBD 等離子體處理S.aureus 生物膜后胞內(nèi)ROS 含量變化

如圖7 所示，等離子體放電處理3.0 min 可分別使得S.aureus 胞內(nèi)相對(duì)ROS 水平增加14.9±8.6%，增加未超過(guò)1.2 倍，處于較低的水平。在細(xì)胞正常代謝過(guò)程中，ROS 的產(chǎn)生是一種正常的生理過(guò)程。ROS可以作為信號(hào)分子或者二級(jí)信使，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)，且激發(fā)細(xì)胞體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，以此來(lái)減少外界氧化損害，從而在面對(duì)環(huán)境壓力的時(shí)候起到保護(hù)作用。而在持續(xù)的外界壓力情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS 濃度大幅度提高，會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的組分。實(shí)驗(yàn)表明，在一定的時(shí)間內(nèi)，DBD 等離子體處理可引起S.aureus 胞內(nèi)ROS 水平的大量升高，且隨著放電時(shí)間的增加，ROS 水平增加也相應(yīng)更明顯。等離子體處理12.0 min后，胞內(nèi)相對(duì)ROS 提高51.1±14.2%，說(shuō)明DBD 等離子體射流處理一定時(shí)間可導(dǎo)致S.aureus 胞內(nèi)ROS的積累。有研究表明，DBD 直接處理S.aureus 會(huì)氧化細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)，而且會(huì)引起胞內(nèi)ROS 的升高，破壞細(xì)胞內(nèi)膜和其他結(jié)構(gòu)分子，導(dǎo)致生理功能破壞，最終細(xì)菌死亡。0～24.0 min 內(nèi)的ROS 上升規(guī)律與S.aureus生物膜的滅活率保持一致，說(shuō)明胞內(nèi)ROS 含量與細(xì)胞死亡正相關(guān)。而且隨著放電時(shí)間增加，兩種體系中活性物質(zhì)含量也逐漸升高，在細(xì)胞內(nèi)外共同對(duì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)產(chǎn)生氧化作用，促進(jìn)細(xì)菌失活。因此，等離子體放電引起S.aureus 生物膜細(xì)菌胞內(nèi)ROS 升高是滅菌的重要原因。

4 結(jié)論

DBD 等離子體處理水中S.aureus 生物膜24.0 min后，生物膜中細(xì)菌量失活了102.2CFU/mL。經(jīng)DBD 等離子體處理后溶液中的長(zhǎng)壽命活性物質(zhì)含量均有不同程度的提高，S.aureus 生物膜中細(xì)菌的新陳代謝能力與未經(jīng)等離子體處理時(shí)相比降低了78.5%，細(xì)菌胞內(nèi)ROS 含量與處理時(shí)間為0 min 時(shí)相比增加了70.2%。另外，隨著放電時(shí)間的延長(zhǎng)，S.aureus 胞內(nèi)ROS 的含量持續(xù)增加，等離子體放電產(chǎn)生的活性基團(tuán)與細(xì)胞內(nèi)ROS 協(xié)同作用可能是造成S.aureus 生物膜細(xì)菌失活的主要原因。綜上所述，DBD 等離子體是一種高效滅活S.aureus 生物膜的方法，有望在實(shí)際水體滅菌時(shí)應(yīng)用。