miR-182對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞中乳糖合成的影響

朱云菲，賈聚晨，趙天奪，王若薇，張莉，崔英俊，王春梅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

0 引言

乳糖不僅是牛奶中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，還可通過維持牛奶的滲透壓來控制牛奶的體積。而葡萄糖是合成乳糖的主要前體，由于乳腺細(xì)胞中缺乏葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase），導(dǎo)致乳腺本身不能從其他前體合成葡萄糖，因此，乳腺的葡萄糖需求主要依賴于血液中的葡萄糖通過運(yùn)輸至乳腺細(xì)胞內(nèi)[1]。大量研究表明miRNA可廣泛存在并參與真核生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、凋亡及死亡等眾多生命過程中[2-4]，近幾年來隨著對(duì)miRNA在生理方面的研究逐漸增多，關(guān)于miRNA可參與乳腺發(fā)育及泌乳過程的證據(jù)也越來越多[5-6]。miR-182是由Lagos-Quintana等[7]于2003年在小鼠體中第一次發(fā)現(xiàn)的miRNA，miR-182與其他miRNA一樣可通過靶向不同的mRNA調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)，如研究發(fā)現(xiàn)miR-182可通過調(diào)節(jié)肌肉中的葡萄糖利用，調(diào)節(jié)血糖水平[8]；miR-182下調(diào)顯著抑制了RBP-J缺陷細(xì)胞中由TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成程序的增強(qiáng)，降低了骨質(zhì)溶解風(fēng)險(xiǎn)[9]等。但目前為止，關(guān)于miR-182參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的研究仍多集中在病理過程，尤其是腫瘤及癌癥等重大疾病中，如在膠質(zhì)瘤[10]、卵巢癌[11]、乳腺癌[12]中等，而其在生理活動(dòng)中發(fā)揮的作用仍有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果中表明miR-182在高品質(zhì)乳和低品質(zhì)乳奶牛乳腺組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)[13]，暗示miR-182可能參與泌乳過程，但具體的作用機(jī)制仍不明確，故本實(shí)驗(yàn)將對(duì)miR-182在泌乳期DCM ECs中所發(fā)揮的影響作用進(jìn)行研究，并從分子水平探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的獲取與鑒定

本實(shí)驗(yàn)將選取泌乳期的健康中國(guó)荷斯坦奶牛乳腺組織，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前的原代細(xì)胞采集操作[14]，使用酶消化法，在超凈工作臺(tái)中獲得原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型，在5%CO2、37℃無菌恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)備用或凍存于液氮中待日后復(fù)蘇取用，并通過免疫熒光染色法對(duì)原代乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行角蛋白18染色鑒定[15]。

1.1.2 試劑

DMEM-F12培養(yǎng)基粉末,美國(guó)Sigma-aldrich公司；LB肉湯培養(yǎng)基粉末,青島海博有限責(zé)任公司；Lipofectamine2000、Trizol和DEPC原液,美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit和TB GreenTM premix Ex TaqTMⅡ,大連Takara公司；SDS-PAGE快速配膠試劑盒，上海碧云天有限責(zé)任公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光液，安徽Biosharp公司；細(xì)胞角蛋白18（CK18）抗體，美國(guó)BIOSS公司；β-actin一抗和GLUT 1一抗，武漢ABclonal公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，北京中杉金橋有限責(zé)任公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Promega公司；牛乳糖ELISA KIT，上海瑞番有限責(zé)任公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo；SWCJ-IFD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰；MLS-3020高壓濕熱滅菌鍋，日本Sanyo；Z 300-K冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hermle；PCR儀，德國(guó)Eppendorf；Quan Studio Realtime PCR System和EVOSTM7000成像系統(tǒng)-熒光顯微鏡，美國(guó)Invitrogen；Promega Glomax 20/20發(fā)光檢測(cè)儀，美國(guó)Promega；超敏發(fā)光儀，上海勤翔；Spectra－Maxi3x多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MOLECULAR。

1.2 方法

1.2.1 雙熒光素酶活性檢測(cè)miR-182與SLC2A1之間靶向關(guān)系

根據(jù)在線生物學(xué)信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-182與SLC2A1(溶質(zhì)載體家族2促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員1,transporters solute carrier family 2 member 1)的3’UTR區(qū)域可能存在的潛在結(jié)合位點(diǎn)對(duì)結(jié)合位點(diǎn)所在上下游50-100bp長(zhǎng)度基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，并通過酶切、T4連接、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將特定基因序列片段結(jié)合到psiCHECK-2載體上構(gòu)成野生型質(zhì)粒(wt-SLC2A1)。突變型質(zhì)粒(mut-SLC2A1)由上海生工生物有限公司合成。將293T細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)后接種于12孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合至70%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，每孔加入1μg重組質(zhì)粒，將含有目的基因片段psiCHECK-載體與miR-182mimics使用轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM 3000，Thermo Fisher)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染分組如下：wt-SLC2A1+miR-182mimics、wt-SLC2A1+miR-182mimics NC、mut-SLC2A1+miR-182mimics、mut-SLC2A1+miR-182mimics NC，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。

1.2.2 miR-182對(duì)SLC2A1表達(dá)水平影響的檢測(cè)

將DCMECs復(fù)蘇培養(yǎng)后接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合至70%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分組如下：miR-182 mimics、miR-182 mimics NC，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞總RNA樣品，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)SLC2A1 mRNA基因水平變化，熒光定量PCR反應(yīng)所用到的試劑盒均來自Takara公司，SLC2A1及內(nèi)參基因β-actin引物均由上海生工合成，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，檢測(cè)后對(duì)QuantStudioTMDesign&Analysis Software獲得的溶解曲線和擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，利用得到的Ct值通過2-ΔΔct分析方式進(jìn)行計(jì)算。

將DCMECs復(fù)蘇培養(yǎng)后接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合至70%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分組同上，轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞總蛋白樣品，通過western blotting(WB)技術(shù)檢測(cè)SLC2A1編碼蛋白GLUT 1的表達(dá)變化，即使用制備好的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳后再濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂乳封閉，封閉結(jié)束后進(jìn)行一抗4℃過夜孵育，二抗37℃搖床80 r/min條件下孵育2 h。一抗和二抗孵育完成后滴加發(fā)光液放入成像儀中曝光顯色，最后將曝光后所得條帶通過軟件Image J讀取蛋白灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 miR-182對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳糖合成的影響

將DCM ECs復(fù)蘇培養(yǎng)后接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合至70%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分組同1.3，轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集各孔細(xì)胞上清液至ep管中備用。使用牛乳糖酶聯(lián)測(cè)定試劑盒(瑞番)進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，并在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm處測(cè)量各孔的吸光度后通過換算計(jì)算乳糖的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prim 8.0.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，分析結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)值分析比較。無標(biāo)記表達(dá)差異不顯著，“**”表示P＜0.01、“*”表示P＜0.05，表達(dá)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光染色法對(duì)原代乳腺上皮細(xì)胞具有的特異性表達(dá)標(biāo)志物—角蛋白18（CK18）進(jìn)行特異性染色，以鑒定純化后的細(xì)胞是否是DCM ECs，結(jié)果如圖1所示，藍(lán)色熒光染色的為細(xì)胞核，在細(xì)胞核周圍有大量的角蛋白18(綠色熒光)表達(dá)，表明此細(xì)胞為DCMECs，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

將含有目的基因片段的psiCHECK-2載體與miR-182 mimics共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，共轉(zhuǎn)染wt-SLC2A1與miR-182 mimics時(shí)，熒光素酶活性顯著下降，但共轉(zhuǎn)染wt-SLC2A1與miR-182 mimics NC及mut-SLC2A1與miR-182 mimics時(shí)，熒光素酶活性無顯著差異變化。結(jié)果表明，miR-182可通過預(yù)測(cè)的靶向結(jié)合位點(diǎn)與SLC2A1發(fā)生負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖2 雙熒光素酶活性檢測(cè)

2.3 miR-182對(duì)基因表達(dá)水平影響的檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 miR-182對(duì)SLC2A1 mRNA基因水平表達(dá)的影響

為確定miR-182是否會(huì)影響DCMECs中SLC2A1的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)使用qPCR技術(shù)分別檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組DCMECs中SLC2A1基因mRNA水平的表達(dá)變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染miR-182 mimics后，SLC2A1基因mRNA的表達(dá)量顯著低于陰性對(duì)照組及空白處理組(P＜0.01)，說明miR-182過表達(dá)可抑制DCMECs中SLC2A1的表達(dá)。

圖3 miR-182對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的SLC2A1 mRNA表達(dá)水平的影響

2.3.2 miR-182對(duì)GLUT 1蛋白水平表達(dá)的影響

SLC2A1基因編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporters 1，GLUT1)，是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的主要成員之一,主要通過調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)速度參與DCMECs中乳糖的合成和分泌。為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-182是否會(huì)影響DCMECs中SLC2A1編碼蛋白GLUT 1的表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)使用WB技術(shù)分別檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組DCMECs蛋白樣品中GLUT1的蛋白水平表達(dá)變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染miR-182 mimics后，GLUT1蛋白的表達(dá)量顯著低于陰性對(duì)照組及空白處理組(P＜0.01)，說明miR-182過表達(dá)可抑制DCMECs中GLUT1的表達(dá)。

圖4 miR-182處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后GLUT1蛋白的表達(dá)量檢測(cè)

2.4 miR-182對(duì)DCMECs中乳糖含量的影響

為確認(rèn)miR-182對(duì)DCMECs中乳糖合成的影響，本實(shí)驗(yàn)通過使用牛乳糖酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)了各轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞上清液中乳糖的含量(mg/L)變化情況。使用試劑盒配置的標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，將所得OD值代入曲線分別計(jì)算各組細(xì)胞中乳糖的含量。結(jié)果如圖5所示，即轉(zhuǎn)染miR-182 mimics后，處理組的乳糖的含量相較于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比明顯降低(P＜0.01)，表明miR-182過表達(dá)可顯著抑制DCMECs中乳糖的合成。

圖5 miR-182處理后奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌的乳糖含量的檢測(cè)

3 討論

近年來關(guān)于miRNA在乳腺的發(fā)育及泌乳中也發(fā)揮著作用的研究逐漸增多，研究表明，miRNA在乳腺發(fā)育的不同階段起著重要作用，其中哺乳期間一些重要的miRNA差異表達(dá)[16-17]，暗示著miRNA也影響泌乳過程，如Lu等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-205可通過影響干細(xì)胞自我更新和分化從而促進(jìn)乳腺發(fā)育；Hao等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-432可影響綿羊乳腺上皮細(xì)胞中乳脂的合成；陸黎敏等[20]研究發(fā)現(xiàn)let-7g可通過靶向結(jié)合TGFBR 1基因負(fù)向調(diào)控其表達(dá)，從而起到調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞的增殖及β-酪蛋白分泌的作用等。溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白(solute carrier(SLC-)transporters)家族是一類存在于細(xì)胞上，負(fù)責(zé)細(xì)胞膜上的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，其中SLC2A1則主要負(fù)責(zé)飽和的、立體選擇性的、雙向的、不依賴能量的葡萄糖易化擴(kuò)散[21]，大量研究證明，由SLC2A1編碼的GLUT1蛋白被認(rèn)為是負(fù)責(zé)基礎(chǔ)葡萄糖攝取的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體[22]，是在乳糖合成過程中至關(guān)重要的影響因素[23]，多年來研究熱度居高不下，但多集中在病理過程中，如在胃癌中通過影響糖酵解過程影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)遷移[24]，SLC2A1變異表達(dá)可引起新生兒發(fā)生低血糖癥[25]等，因此miR-182如何通過調(diào)節(jié)SLC2A1的表達(dá)從而影響DCMECs中乳糖合成的具體機(jī)制值得更進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過探討miR-182與SLC2A1的靶向調(diào)節(jié)進(jìn)一步影響DCMECs中乳糖合成，為深入研究奶牛泌乳調(diào)控機(jī)制及改善乳制品質(zhì)量提供了一個(gè)新的理論方向，同時(shí)也促進(jìn)了miRNA與靶基因在生理過程中發(fā)揮作用的具體作用機(jī)制相關(guān)的研究進(jìn)度。

4 結(jié)論

MiR-182可與SLC2A1的3’UTR區(qū)域發(fā)生靶向結(jié)合，并負(fù)調(diào)控SLC2A1的基因表達(dá)水平，從而影響DCMECs中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程，進(jìn)一步影響DCMECs中的乳糖的合成及分泌，即miR-182可通過負(fù)調(diào)控SLC2A1表達(dá)從而抑制DCMECs中的乳糖的合成。