核桃凍干酸奶的研制

顧凡，徐志濤，趙存朝,2，陶亮,2，田洋,2,3

（1.云南農業大學食品科學技術學院，昆明650201；2.食藥同源資源開發與利用教育部工程研究中心，昆明650201；3.云南省藥食同源功能食品工程研究中心，昆明650201）

0 引言

核桃（Juglans regia L.）為胡桃科核桃屬植物，營養價值較高，是世界“四大干果”之一[1-2]，果仁中含有豐富的蛋白質，有很高的食用價值和保健功能[3]。核桃屬于藥食兼用資源，含有豐富的微量元素[4]，對人體具有多種益處[5]。核桃中的不飽和脂肪酸主要有亞麻酸、油酸等[6]，具有防止頭發脫落、高血糖、高血壓的潛在功能[7]。目前，核桃在國內廣泛種植，截至2020年，云南核桃種植面積已達4.303×107畝，年產量1.125×106t，產值412億元，均位居全國之首[8]，但精深加工不足產值較低，亟需開發核桃類產品。

由于技術革新和產品需要，真空冷凍干燥（freeze-drying，FD）技術在食品工業中被廣泛使用。FD技術利用原材料中的水分升華的原理，將水分直接升華成蒸汽，并將其從材料中排出。這一過程始終在低溫、真空和低氧條件下進行，使好氧微生物的生長和生物酶的活性得到了有效的抑制。在物料中的營養物質得到了極大的保留[9]的情況下，達到干燥的效果，有利于在室溫下長期儲存和運輸。蘇德亮等人[10]利用FD制備凍干酸奶塊，歐陽銳等人[11]利用FD制備凍干黃花梨酸奶，FD技術在乳品產業中應用成熟，產品具有創新性。

酸奶具有營養價值高，易消化吸收，改善腸道健康等優點，但目前主要以牛奶等動物源蛋白為主，植物類或者動植物蛋白復合型酸奶品類較少，同時，市場上的酸奶基本以液體或半固體為主，保質期較短，運輸保藏條件嚴格，益生菌衰亡較快[12]。乳品工業常用的發酵菌種有嗜熱鏈球菌[13]、瑞士乳桿菌[14]、植物乳桿菌[15]、嗜酸乳桿菌[16]、德氏乳桿菌保加利亞亞種[17]，每種菌種均具有不同的特性，聯合發酵將有助于縮短發酵時間和獨特風味的形成[18]。本研究以新鮮去種衣核桃仁為原料，經打漿、均質后多菌種聯合發酵制備核桃發酵物，同時以牛乳為原料經發酵制備牛奶發酵乳，把牛奶發酵乳與核桃發酵物按比例混合均勻，真空冷凍干燥后粉碎制成核桃酸奶凍干粉。加大了核桃的利用度，提高核桃的產值，彌補液體酸奶的不足[19-21]。核桃酸奶凍干粉實現了動物蛋白與植物蛋白的結合，符合國家發展“雙蛋白工程”發展需求，可為人體提供更為全面的動植物源營養成分，同時本產品加入冷水攪拌后即迅速恢復為酸奶的流體狀態，也可直接食用，有酸奶口感風味且質地如威化餅干，是一款新型的酸奶食用形式，同時也可為核桃新產品的研發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要原材料

新鮮核桃，云南大理白族自治州；鮮牛奶，云南農業大學畜產品加工中心；CICC 6063嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、CICC 6064瑞 士 乳 桿 菌(Lactobacillus helveticus)、CICC 20264 植 物 乳 桿 菌(Lactobacillus plantarum)、CICC 22150 嗜 酸 乳 桿 菌(Lactobacillus acidophilus)、CICC 20247德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus），由云南農業大學食品科學技術學院提供，制成比例為1∶1∶1∶1的發酵劑。

1.2 儀器與設備

A360紫外可見分光光度計，上海翱藝儀器有限公司；TGL20M高速冷凍離心機，湖南湘立科學儀器有限公司；SVJ-358智能商用型酸奶機，北京世紀陽光發展科技有限公司；SOX 406脂肪測定儀，山東海能科學儀器有限公司；HYP-1008消化爐，上海纖檢儀器有限公司；KN 520凱氏定氮儀，阿爾瓦儀器；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技；SCIONSQ-456-GC-MS氣相色譜質譜聯用儀，美國布魯克；NU-4750E型CO2培養箱，美國Nuaire公司；高壓滅菌鍋、SX-500型高壓蒸汽滅菌器，日本Tomy公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵核桃液菌種篩選

將菌種活化，選取經馴化的菌種，根據前期預實驗將嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌按1∶1∶1∶1比例加入核桃液中聯合馴化三代后按一定的接種量加入均質好的核桃漿中發酵制備核桃發酵物。

1.3.2 加工工藝設計

（1）核桃發酵液加工工藝設計。

新鮮核桃的挑選→去殼去種衣→加水打漿（核桃仁重∶水重=1∶1.5，5 min）→均質（5～6 MPa）→殺菌（100℃，15 min）→接種發酵劑（瑞士乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌按1∶1∶1∶1）→發酵（40℃，15 h）→冷藏（4℃）→成品備用。

（2）牛奶發酵乳加工工藝流程。

鮮牛奶→加蔗糖（15%）→預熱（50～60℃）→均質（8～10 MPa）→殺菌（巴氏殺菌，85℃，15 min）→冷卻→接種發酵劑4%（保加利亞乳桿菌：嗜熱鏈球菌=1∶1，利用脫脂奶粉為培養基復壯菌種）→發酵（42℃，8 h）→冷藏后熟（4℃，12 h）→成品備用。

（3）核桃酸奶凍干粉工藝流程。

調配（發酵好的核桃液：后熟好的牛奶發酵乳=1∶2）→低溫環境中攪拌（4℃）→分盤→入倉→冷凍→干燥→出倉→分裝→密封包裝→成品。

1.3.3 單因素實驗

經前期預實驗，確定起始條件為液料比為1.5，復配菌添加量3%，發酵時間15 h，發酵溫度40℃，牛奶發酵乳與核桃漿發酵液復配比例為1.5，在此基礎上依次研究液料比（0.5、1、1.5、2、2.5），復配菌添加量（1%、2%、3%、4%、5%），發酵時間（9、11、13、15、17 h），發酵溫度（36、38、40、42、44℃），牛奶發酵乳與核桃漿發酵液復配比例（0.5、1、1.5、2、2.5）對核桃凍干酸奶的影響。

1.3.4 響應面優化實驗

根據單因素試驗結果，選擇核桃發酵液菌種接種量（X1）、核桃發酵液發酵時間（X2）、核桃發酵液發酵溫度（X3）和牛奶發酵乳：核桃發酵液的比例（X4）進行響應面實驗，因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平

1.3.5 感官評價

建立核桃酸奶凍干粉感官評分標準，滿分100分，感官評分標準見表2，邀請20名經3天培訓的專業人士從組織狀態、口感、風味、色澤4個方面對核桃酸奶凍干粉進行評價。

表2 核桃酸奶凍干粉感官評定評分表

1.3.6 指標測定

參考國標測定蛋白質[22]、脂肪[23]、水分[24]、灰分[25]、大腸桿菌[26]、霉菌[27]、沙門氏菌[28]、金黃色葡萄球菌[29]，細菌菌落數，按照平板計數法測定。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 核桃漿料液比對核桃酸奶凍干粉的影響

由圖1可知，隨著核桃漿液料比的增大，核桃酸奶凍干粉的感官評分在料液比小于1.5時呈上升趨勢，分析其原因是水分含量較少發酵液太濃稠，不利于菌種的擴散增殖和生長，同時水量較少影響了蛋白、多糖等營養物質及風味物質的浸出率[30]，產品的感官質量偏低；隨著加水量的增加，核桃漿的濃稠度適宜，菌種發酵較好，增加了營養物質和風味物質的溶出，感官評分呈現上升的趨勢。在液料比為1.5（1.5∶1）時，核桃漿發酵產物的感官品質達到最高，得分為（83.25±1.31)分，隨后，感官評分開始逐漸下降，水量的過度添加，導致核桃發酵液狀態變得過稀，風味及色澤不正，味道寡淡，后期與牛奶發酵乳混合后影響了最終產品的滋味和色澤品質，核桃酸奶凍干粉濃郁的核桃滋味缺失，色澤由亮黃色變成淡黃色，影響核桃酸奶凍干粉整體感官品質，故最終選取最適核桃漿料液比為1.5。

圖1 核桃漿液料比對核桃凍干酸奶的影響

2.1.2 核桃漿發酵液中菌種接種量對核桃酸奶凍干粉的影響

如圖2所示，隨著核桃發酵液中混合菌種接種量（嗜熱鏈球菌∶瑞士乳桿菌∶植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌為1∶1∶1∶1）的增加，感官評分在菌種添加量小于3%時呈現趨勢增大，在添加量為3%處達到最大值（85.60±2.53）分。接種量較小時，核桃發酵液中菌落數量較低，達不到合適的酸度，適口性差；接種量為3%時，發酵液感官狀態最好，使得發酵液具有獨特的風味，并且組織狀態均勻，有較好的適口性。與曾麗萍等[31]發現接種量為3%～4%時，既具有良好的益生性能，感官評分也較高的結果一致。隨著接種量的不斷增加，核桃發酵過度，從而使發酵液口味偏酸，并伴有苦澀味，p H降低，會使其蛋白質變性嚴重，同時出現了組織狀態不均勻、色澤發黃以及顆粒結塊的現象，這與于素素等[32]發現的隨著菌種添加量的增加，有尖酸味一致。因此，最終選擇最佳接種量為3%。

圖2 復配菌添加量對核桃凍干酸奶的影響

2.1.3 核桃發酵液發酵時間對核桃酸奶凍干粉的影響

由圖3可知，隨著核桃漿發酵時間的增加，發酵不斷進行，小于15 h感官評分不斷升高，在15 h達到最大值（86.82±1.28）分，經分析，在此期間，菌體的生長和繁殖進入對數增長階段，導致發酵液中可發酵糖的消耗率顯著增加，酸度也顯著增加。隨后，菌體的生長進入平緩階段，菌體的生長代謝速度減慢，酸度增加不明顯，味道適中。這與劉海燕等[33]研究發酵花生芽漿的結果一致。隨著發酵時間的延長，感官評分出現下降，分析其原因是發酵時間過長產酸較多，導致核桃酸奶凍干粉偏酸，甚至出現微苦味，這與李翔等[34]在研究藜麥核桃酸奶結果類似。同時，選擇最適發酵時間為15 h，也可與牛乳的發酵與后熟時間保持一致，方便核桃酸奶制備過程中核桃漿發酵物與牛乳發酵乳同時制備完成，利于混料。

圖3 核桃漿發酵時間對核桃凍干酸奶的影響

2.1.4 核桃發酵液發酵溫度對核桃酸奶凍干粉的影響

如圖4所示，在發酵溫度小于40℃時，味道寡淡，感官評分較低，在核桃漿發酵液發酵溫度為40℃處，核桃發酵漿酸甜適中，適口性較好，感官評分達到最大值（80.6±0.7）分。其原因可能是因為發酵過程中有最適的發酵溫度，溫度過高和過低都會影響混合菌種的活性，不利于發酵。賈凌云[35]和馬昱陽[36]等研究也證實低溫不利于菌種生長，40～42℃發酵時口感以及香氣均較好，且活菌數可達到2.08×108CFU/m L，適合發酵乳的制備。故選擇最佳發酵溫度為40℃。

圖4 核桃漿發酵溫度對核桃凍干酸奶的影響

2.1.5 酸奶和核桃發酵液的配比對核桃酸奶凍干粉的影響

由圖5可知，隨著牛奶發酵乳與核桃漿發酵液復配比例的增大，核桃酸奶凍干粉的感官評分趨勢呈先上升后下降，在比例為1.5時最高，為（83.43±1.31）分，此時，牛奶發酵的酸香味和核桃的清香口感完美搭配，口感細膩爽滑，風味濃郁。牛奶發酵乳比例較低時，核桃酸味過重，奶香味不足，口感不協調，感官品質較差。但當牛奶發酵乳的比例過高（比例超過1.5）時，感官評分下降，此時核桃凍干酸奶的酸奶味過重，核桃濃郁的香味缺失，甚至品嘗不出核桃的味道，影響感官評分指標。故牛奶發酵乳與核桃漿發酵液的最適復配比例為1.5。

圖5 牛奶發酵乳與核桃漿發酵液復配比例對核桃凍干酸奶的影響

2.2 響應面優化

2.2.1 響應試驗設計及結果

響應面試驗結果見表3。

表3 響應面分析方案及結果

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗

對表3進行響應面分析，得到核桃凍干酸奶產品感官評分與核桃漿發酵液菌種添加量（X1）/%、核桃漿發酵液發酵時間（X2）/h、核桃漿發酵液發酵溫度（X3）/℃和牛奶發酵乳：核桃漿發酵液的比例（X4）的二次方程模型為:Y=82.02+1.2X1-0.22X2+2.37X3+0.66X4- 2.79X1X2-0.47X1X3-0.57X1X4-0.92X2X3-4.07X2X4-1.31X3X4-3.4X1-5.11X22-3.66X32-1.71X42回歸模型的方差分析結果見表4。

由表4方差分析可知，P=0.0001＜0.01，說明二次多元回歸模型極顯著；失擬性檢驗P=0.127＞0.05，失擬不顯著，說明該模型與實際情況比較吻合[37]。比較回歸系數的顯著差異，各因素對核桃凍干酸奶影響程度依次為：核桃漿發酵液發酵溫度（X3）/℃＞核桃漿發酵液菌種添加量（X1）/%＞牛奶發酵乳：核桃漿發酵液的比例（X4）＞核桃漿發酵液發酵時間（X2）/h。

表4 方差分析結果

2.2.3 響應面優化

由圖6可知，X1與X2，X2與X4之間交互作用顯著（P＜0.05），對核桃酸奶凍干粉感官評分影響較大。核桃發酵液發酵時間及牛奶發酵乳：核桃發酵液的比例變化曲面比較陡峭，核桃發酵液發酵時間為15 h，牛奶發酵乳：核桃發酵液的比例為2時，核桃凍干酸奶的感官評分值最大，交互作用顯著與蒲立檸等人[38]分析結果一致。

圖6 各因素對感官評分的影響

2.2.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

通過響應面法確定最佳的核桃凍干酸奶生產條件，具體為菌種添加量3.32%，核桃發酵液發酵時間14.51 h，核桃發酵液發酵溫度40.36℃和牛奶發酵乳：核桃發酵液的比例為2.17預測的核桃酸奶凍干粉的感官評分值為85.05分。考慮實際操作條件和調節設備參數，最終確定核桃酸奶凍干粉工藝條件為：核桃發酵液菌種添加量3%，核桃發酵液發酵時間15 h，核桃發酵液發酵溫度40℃，核桃發酵液比例為2，得到核桃凍干酸奶的感官評分值為(83.62±1.31)分，與理論值接近。

3 產品質量

3.1 核桃漿發酵前后水溶性風味物質變化

3.1.1 核桃漿發酵前后游離氨基酸含量變化

根據氨基酸的滋味描述[39]，對核桃中氨基酸滋味描述見表5。

表5 核桃發酵/核桃游離氨基酸總量對比

由表5顯示，核桃漿被發酵后，17種游離氨基酸的總含量有很大變化，其游離氨基酸總量由發酵前的(279.97±2.92)mg/kg增加到發酵后的(1262.00±5.22)mg/kg，各氨基酸均有不同程度的增加，其原因可能是發酵過程中蛋白質、多肽等含氮化合物逐漸降解導致氨基酸含量增加。氨基酸在人體中起重要的作用，如亮氨酸在合成蛋白質、能量代謝、葡萄糖平衡等方面具有重要作用[40]，纈氨酸是合成各類抗體、激素以及酶等的原料，是維持人生命活動的重要物質[41]，精氨酸是機體合成細胞蛋白質的原料，參與尿素、肌酸、NO、谷氨酰胺等的合成，在生長性能、抗氧化性能、免疫功能及腸道發育功能等方面發揮重要的生理學作用[42]。發酵后營養物質增加，雖然核桃發酵液口感略帶一點苦味，但整體適口性較好，后期與高甜度牛奶發酵乳復配，其風味得到大大改善，品質較佳。

3.1.2 核桃漿發酵前后游離脂肪酸含量變化

這5種游離脂肪酸是核桃中的主要脂肪酸成分[43]，對風味具有重要的貢獻[44]。由表6顯示，核桃經過發酵后5種游離脂肪酸中有3種含量增多了，分別是十八烷酸（硬脂酸）、亞油酸、α-亞麻酸，其中起到益智、降血壓、降血脂作用的α-亞麻酸[45]增長明顯，由發酵前的(6.51±0.11)%增加到發酵后的(7.30±0.15)%，發酵后的核桃漿營養價值更高。

表6 核桃發酵/核桃游離脂肪酸含量對比

大量研究發現發酵前后其成分會發生變化[46]，與本研究核桃發酵液各種游離氨基酸及脂肪酸不管在總量還是各成分的分量上，有不同程度的明顯增加一致，在風味貢獻上起到中重要作用。發酵后的核桃在營養方面比沒有發酵的核桃更好，營養物質增多，且經微生物酵解后更容易吸收[47]，真空冷凍干燥技術[48]能最大限度的保持原料的營養成分，故生產出來的核桃酸奶凍干粉是一款營養豐富，便于攜帶和儲藏的獨特風味酸奶。

3.2 核桃凍干酸奶產品質量

（1）核桃凍干酸奶產品感官質量。參考叢懿潔[49]等人研究，邀請20名專業人士對核桃凍干酸奶產品從組織狀態（硬度、拉絲感、質地細膩、顆粒感、黏度）、口感（細膩、核桃味、酸味、不自然感、奶香味、澀味、甜味）、風味（核桃風味、腥味、發酵味、酸味、奶香風味）、色澤（淡黃色、顏色較深、褐色、乳白色）4個方面對核桃酸奶凍干粉感官評價，結果如圖7所示。

圖7 核桃凍干酸奶感官剖面圖

由圖7可以看出，核桃凍干酸奶是一款顏色淡黃、口感細膩，酸味適中、具有奶香風味和核桃風味的新型酸奶。

（2）核桃凍干酸奶產品理化及衛生質量。由表7可知，核桃酸奶凍干粉的蛋白質含量約為(11.98±0.21)%，脂肪含量約為(5.22±1.05)%，水分含量約為(4.53±0.15)%，灰分含量約為(3.18±0.080)%，霉菌和酵母菌為(4.60±0.15)CFU/g，菌落總數為（7.13±1.06）×107CFU/g，大腸菌群和致病菌均未檢出。與楊露西[39]研究藜麥酸奶產品對比，核桃酸奶凍干粉蛋白含量豐富，脂肪含量較高，營養豐富，水分含量較低，易于保藏，致病菌和大腸桿菌均未檢出，是一款營養豐富，味道純正的、安全可靠的風味凍干酸奶。

表7 核桃酸奶凍干粉產品理化及衛生指標

4 結論

本研究優化了核桃發酵液的發酵工藝，在料液比1∶1.5，菌種添加量3%，發酵溫度40℃，發酵時間15 h，牛奶發酵乳與核桃發酵液2∶1的條件下核桃凍干酸奶品質最好，發酵后核桃營養成分有所提高，游離氨基酸由發酵前的(279.97±2.92)mg/kg增加到發酵后的(1262.00±5.22)mg/kg，α-亞麻酸由發酵前的(6.51±0.11)%增加到發酵后的(7.30±0.15)%，最終得到一款方便儲運，營養價值高的美味核桃酸奶凍干粉產品，為云南特色核桃產業的開發提供理論參考，促進了云南乳品產業的發展。