高效液相色譜-蒸發光散射法同時測定乳清蛋白粉中5種磷脂

李博群，宋戈，孫立慶，王蕓，周紅，楊玉琢，楊文敏

（黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱150028）

0 引言

磷脂在嬰兒大腦生長發育過程中具有非常重要作用，是構成生物膜的重要物質。牛乳、蛋黃和大豆中都含有相當數量的磷脂，但只有牛乳中的磷脂在整體組成上與母乳類似，只是組分含量有一定差異[1]。在牛奶中磷脂是構成乳脂球膜的重要組成，主要的種類有磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)、鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)和磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)[6-10,24-25]。以牛乳為原料制成的乳清蛋白粉中包含乳脂肪球膜蛋白，含有豐富的磷脂。由于磷脂的種類較多,脂肪酸組成差異較大，目前在磷脂的提取和檢測方面還存在許多挑戰，優化和改進磷脂檢測方法具有重要意義[2-4]。近年來，飛行時間質譜技術以其獲得結構信息、高選擇性和高靈敏度等優點，在研究磷脂的構成和測定中發揮了重要的作用[5-10]。也有采用串聯四級桿質譜對磷脂定量測定[23-25]進行研究的相關方法，但對儀器配備和標準品的要求高，檢測成本高，難以普及。而目前采用液相色譜聯用蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)只能針對1到3種磷脂進行檢測[11-17]，當分離檢測多種磷脂時，對色譜分離條件要求較高，分離度較差，達不到定量的要求[18-22]。本方法針對乳清蛋白粉，通過三氯甲烷甲醇溶液提取，除去樣品中蛋白質，再經水溶液除雜后濃縮，利用硅膠色譜柱分離，采用高效液相色譜－蒸發光散射法對5種磷脂進行檢測，并在實際樣品的檢測中得以應用，為進一步研究強化磷脂的食品檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇（純度≥95%），SIGMA公司；乙腈(色譜純)、乙酸銨(色譜純)、三氯甲烷(色譜純)、甲醇(色譜純)，美國默克公司；冰乙酸(色譜純)，氯化鉀(色譜純)，科密歐公司。所有用水均為電阻率≥18.2 MΩ°cm的超純水，以上試劑除標注的外均為分析純。

1.2 儀器設備

Waters2695高效液相色譜儀，美國waters公司；Alltech2000蒸發光散射檢測器,美國奧泰公司；2300TH型超聲波振蕩儀，安譜公司；TTL-DCⅡ水浴加熱儀,北京同泰聯科技有限公司；p B-10酸度計，德國Sartorius公司；KQ-250DE超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器公司；VORTEX 3渦旋混合器，德國IKA公司；SQP天平，德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

磷脂系列標準儲備溶液：分別稱取適量的（精確至0.1 mg）磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇標準物質于10 mL容量瓶中，用三氯甲烷甲醇溶液（體積比1∶1）溶解并定容，折算純度后達到10 mg/mL。-18℃保存，有效期一周。

磷脂混合標準工作溶液：分別準確移取磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇標準儲備溶液1.0 mL至10 mL容量瓶中，用三氯甲烷甲醇溶液（體積比1∶2）溶解并定容，搖勻后再吸取0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL至10 mL容量瓶中，用三氯甲烷甲醇溶液（體積比1∶2）溶解并定容。磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇標準工作溶液濃度分別為0、5、10、50、100、200、500、1 000μg/m L，臨用前配制。

0.01 mol/L氯化鉀溶液：稱取0.7455 g氯化鉀，500 mL水溶解，定容至1 L，1~8℃保存，有效期一周。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：NUCLEISIL50-5 5μm，250 mm×3.0 mm（內徑）；柱溫：25℃；檢測器：蒸發光散射檢測器；漂移管溫度為90℃；氣流量為2.2 L/min；進樣體積：10μL；流動相A為95%乙腈(含5%0.01 mol/L的乙酸銨，混勻后用冰乙酸調節p H=5.6±0.5)；流動相B為和50%乙腈(含50%0.01 mol/L的乙酸銨，混勻后用冰乙酸調節p H=5.6±0.5)；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫程序：0→3 min，99%A；3→7 min，99%A勻速降至91%A；7→10 min，91%A勻速降至88%A；10→20 min，88%A勻速降至75%A；20→25 min，75%A；25→27 min，75%A線性升至99%A，保持8 min。

1.3.3 樣品處理

稱取試樣2.5 g，加入一級水25 mL超聲溶解，轉移并用一級水定容50 mL，搖勻后準確吸取1.0 mL，加入9 mL三氯甲烷甲醇溶液(體積比1∶1)溶液于帶蓋離心管中渦旋混合，在混搖振蕩器上振蕩10 min；取出在4 000 rpm下離心10 min，移取上清液于另一帶蓋離心管中，剩余沉淀物加1.0 m L去離子水，振蕩混勻后再加9 mL三氯甲烷甲醇溶液(體積比1∶1)，渦旋混合后在混搖振蕩器上振蕩10 min；取出在4 000 rpm下離心10 min移出上清液；合并的上清液中加入1.0 m L一級水和1.0 mL 0.01 mol/L氯化鉀水溶液渦旋混合后在4 000 rpm下離心10 min，去除上層水相層，下層有機溶液在40度氮吹近干，準確加入三氯甲烷甲醇溶液(體積比1∶2)溶液2.5 mL，振蕩溶解后在5 000 rpm下離心5 min，用0.22μm的有機膜過濾后上機測定。

1.3.4 定量測定

磷脂混合標準工作液和試樣提取液注入高效液相色譜儀中測定，色譜圖如圖1、圖2所示。圖1、圖2中，峰1~峰6分別為1-磷脂酰甘油，2-磷脂酰肌醇，3-磷脂酰乙醇胺，4-磷脂酰絲氨酸，5-磷脂酰膽堿，6-鞘磷脂。

圖1 磷脂混合標準溶液色譜圖

圖2 乳清蛋白粉樣品色譜圖

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

磷脂的主鏈為甘油-3-磷酸，甘油分子中的另外兩個羥基都被脂肪酸所酯化，磷酸基團又可以被各種結構不同的小分子化合物酯化，例如膽堿、乙醇胺、絲氨酸、肌醇，形成磷脂酰膽堿（卵磷脂）、磷脂酰乙醇胺（腦磷脂）、磷脂酰絲氨酸及磷脂酰肌醇等。每一類磷脂可以因其組成的脂肪酸不同而有若干種分子。其中鞘磷脂是含鞘氨醇或二氫鞘氨醇的磷脂，它的分子不含甘油，是其中一分子脂肪酸以酰胺鍵的形式與鞘氨醇的氨基相連，而鞘氨醇或二氫鞘氨醇有長鏈脂肪烴基構成的疏水尾、兩個羥基和一個氨基構成的極性頭。每一類磷脂可因其組成的脂肪酸不同而有若干種分子[6-10,24-25]。

利用結構中的磷酸基團和小分子化合物酯化形成的相同極性頭、親水相相互作用分離模式，能夠使磷脂混合物中的不同脂肪酸構成的每一個磷脂分子種類保留相同，同時從色譜柱流出形成一個色譜峰，便于準確定量。根據文獻[9-10,24-25]采用乙腈和乙酸銨緩沖液作為流動相，基于硅膠色譜柱的親水相相互作用分離模式，流動相的p H會影響磷脂的電離，影響峰形、響應和保留時間。為保證每一類的每種磷脂分子的充分離解，與硅膠色譜柱固定相產生的色譜行為和親水作用力一樣，共流出形成一個色譜峰，試驗比對了1.3.2色譜條件中流動相A和B的p H為3時與p H為5.6時測定磷脂混合物標準溶液，當流動相p H為3.0時，磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰絲氨酸(PS)不能分開，如圖3所示。p H為5.6的流動相分離磷脂混合標準溶液色譜圖見圖1磷脂混合標準溶液色譜圖。當流動相p H過大時，硅膠色譜柱固定相可能會發生流失。將有機相和水相進行預混，再分為流動相的兩路，可以避免純有機相和純水相在梯度洗脫混合時帶來的化學環境波動，保證整個分離過程中流動相的p H穩定，所以確定了1.3.2色譜條件。

圖3 pH3.0的流動相分離磷脂混合標準溶液色譜圖

2.2 檢測器參數的確定

載氣流速和漂移管溫度是蒸發光散射檢測器中兩個可以調節的重要參數，建立HPLC-ELSD分析方法需要對這兩個參數進行優化。由于鞘磷脂出峰時間較晚，受基線干擾大，所以選擇鞘磷脂為代表確定蒸發光散射檢測器的參數。在相同的載氣流速下，漂移管溫度從60℃增加，流動相逐漸得到充分揮發，噪聲不斷降低，而鞘磷脂的響應不斷增加，當漂移管溫度的溫度為90℃時信噪比最高，漂移管溫度的溫度進一步增加，噪聲大小基本維持不變，而鞘磷脂的響應開始大幅度降低，信噪比就降低了如圖4所示，所以漂移管溫度確定為90℃。在其它條件不變的情況下，載氣流速越小，形成的物質粒子半徑越大，對激光的散射能力越強，相應的響應信號越大。但并不是載氣流速越小越好，因為當載氣流速太小時，流動相不能完全揮發，背景噪聲會增加，信噪比也會降低。最優載氣流速應是在可接受噪音的基礎上，產生最大檢測響應值時的最低流速。在相同的漂移管溫度下，載氣流速從1.5 L/min增加，流動相逐漸得到充分揮發，噪聲不斷降低，而鞘磷脂的響應不斷增加，當載氣流速為2.2 L/min時信噪比達到最高，載氣流速進一步增加，噪聲略有降低，而鞘磷脂的響應開始大幅度下降，信噪比就變小了如圖5所示，所以載氣流速確定為2.2 L/min。

圖4 信噪比與漂移管溫度的關系

圖5 信噪比與載氣流速的關系

2.3 樣品提取條件的確定

根據文獻所述方法對樣品提取進行了優化。試驗對比相同體積的樣品溶液用相同體積的提取劑提取，提取劑中三氯甲烷與甲醇的體積比不同對乳清蛋白粉樣品沉淀蛋白、分層以及轉移操作的效果，如圖6所示，得到1 mL樣品溶液加入4 mL三氯甲烷甲醇溶液（三氯甲烷甲醇體積比為1∶2）時，利于轉移提取液?？紤]磷脂易溶于三氯甲烷，試驗又對比1 mL樣品溶液加入不同體積的三氯甲烷甲醇溶液（三氯甲烷甲醇體積比為1∶1）時的效果，如圖7所示。提取后的提取液是三氯甲烷、甲醇與水的混合溶液，含有大量極性小分子化合物。向提取液中加入稀鹽溶液破壞相平衡而分層，促使極性小分子化合物轉移到甲醇水溶液層中，磷脂轉移到下層三氯甲烷層中，棄去上層甲醇水層除雜，如圖8所示，得出在加入1 mL 0.01 mol/L氯化鉀水溶液的基礎上加入1 mL水分層效果較好，沒有損失，最終確定了1.3.3樣品處理方法。

圖6 不同三氯甲烷與甲醇體積比對提取的影響

圖7 不同體積的提取劑對提取的影響

圖8 加水體積對提取液洗滌的影響

2.4 標準曲線和檢出限

散射光的響應值與粒子質量的關系為I＝k mb，m表示待測組分的粒子質量和，I表示待測組分所產生的散射光光強，k,b為常數。通過使用雙對數方法產生線性曲線，即對待測組分的濃度和響應同時取對數,得到線性方程lg I＝blg m＋lg k。取濃度分別為0、5、10、50、100、200、500、1 000μg/mL的磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇混合標準工作溶液，在最佳色譜條件下，進行了標準曲線的測定，得到5種磷脂的回歸方程及線性相關系數、線性范圍，并以3倍信噪比計算出樣品稱取2.5 g的檢出限，如表1所示。

表1 5種磷脂的標準曲線、相關系數以及線性范圍和檢出限

2.5 回收率和精密度

以同一個乳清蛋白粉為實驗材料，稱取2.5 g樣品后，再分別加入2個水平的磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇標樣，對樣品及兩個不同濃度的加標樣品進行6次平行測定，計算樣品測定的精密度和回收率，結果見表2。

表2 5種磷脂測定的回收率和精密度（n=6）

為保證回收率和提取完全，比較1 mL樣品溶液用不同體積的三氯甲烷甲醇溶液（三氯甲烷甲醇體積比為1∶2）與用不同體積的三氯甲烷甲醇溶液（三氯甲烷甲醇體積比為1∶1）時的回收率，如圖9所示，確定用9 mL三氯甲烷甲醇溶液（三氯甲烷甲醇體積比為1∶1）提取1 mL樣品溶液，此時的回收率最高。

圖9 提取劑對回收率的影響

2.6 實際樣品的測定

按照本方法對市售的乳清蛋白粉9個樣品進行5種磷脂含量的測定，結果見表3。從實際樣品的檢測結果來看，靈敏度和準確度可以滿足實際測試的需求。

表3 樣品中5種磷脂的含量（n=2）

3 結論

本文重點研究了乳清蛋白粉樣品中磷脂的提取條件、色譜分離條件和檢測器參數，建立了高效液相色譜蒸發光散射法測定乳清蛋白中5種磷脂的方法。該方法測定結果重現性好，準確度高，簡單易操作，能為乳清蛋白粉樣品中磷脂含量的測定提供參考。乳清蛋白粉樣品中磷脂含量較高，該方法能完全滿足，但對于含量較低的配方奶粉，有待于進一步凈化濃縮，優化處理后才能檢測。