新橙皮苷二氫查耳酮體內降血糖活性

陶福英，禤日翔，戴梓茹*，范和良*，韋佳杏，王培，覃媚，祁岑，郝俊光，

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.北部灣大學食品工程學院欽州市食品風味分析與調控重點實驗室，廣西 欽州 535011）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種多病因引起的慢性代謝性疾病，其特征是持續的高血糖水平[1]，糖尿病會引發多種并發癥，嚴重時會導致殘疾、死亡等[2-3]。在過去的幾十年里，已經開發出了越來越多的藥物用來緩解糖尿病，但這些藥物有一定的副作用。植物來源的化合物正在成為對抗糖尿病等代謝疾病的有利替代品[4]。

新橙皮苷二氫查耳酮（neohesperidin dihydrochalcone，NHDC）是從天然柑橘植物中提取到的新橙皮苷氫化而成的黃酮類衍生物，屬于甜味劑，甜度是葡萄糖的1 500倍～1 800倍[5]。俞福惠等[6]發現NHDC具有強烈的甜味和極佳的屏蔽苦味的功效，能降低人體對飲料或醫藥中苦味的敏感程度，因而在醫藥領域有著廣泛的應用。Takii等[7]在研究酚苷類物質降血糖活性中已經初步證明了NHDC能夠降低小鼠的血糖含量，但關于NHDC降血糖活性的研究并沒有新的進展。雖然關于NHDC降血糖方面的研究較少，但與其具有相似結構的橙皮苷等柑橘類黃酮的降血糖活性一直是研究熱點，例如橙皮苷能夠通過改善葡萄糖代謝相關酶的活性[8-11]、刺激β細胞胰島素分泌[12]、增強胰島素敏感作用[13]等發揮降血糖作用，柑橘黃酮能夠通過抑制糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的活性來促進糖原合成，從而起到調節血糖的作用[14]。

斑馬魚是發育生物學、遺傳學、毒理學、藥理學等研究領域的理想脊椎動物[15]。研究表明斑馬魚血糖調控機制與哺乳動物高度一致[16-17]，斑馬魚產卵量大，生長周期短，在同樣使用葡萄糖浸泡法的情況下，成年斑馬魚造模時間長（＞14 d），而受精120 h后的斑馬魚幼魚卻能快速建立糖尿病模型（＜5 d），大大縮短了實驗周期，有效提高了整體實驗效率，并且幼魚體內與糖代謝相關的胰島等器官已發育完全，能夠作為評價天然化合物抗糖尿病研究的動物模型。基于上述研究，本文以幼魚糖含量為評價指標，參照文獻[16，18]的方法建立斑馬魚幼魚高血糖模型，在建立高血糖模型的同時，擬用NHDC進行干預，通過測定葡萄糖、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、胰島素、糖原含量評價其降血糖活性，為新橙皮苷二氫查耳酮的開發利用及降血糖藥物篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

斑馬魚胚胎：由野生WT品系雌雄魚自然交配而得，WT品系斑馬魚由北部灣大學食品工程學院海洋資源開發與利用課題組提供。

葡萄糖（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；四氧嘧啶（≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；新橙皮苷二氫查耳酮（≥95%）：上海麥克林生化科技有限公司；阿卡波糖（≥98%）：杭州中美華東制藥有限公司；蛋白含量檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒、總膽固醇檢測試劑盒、糖原檢測試劑盒、胰島素檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司。

臺式高速冷凍離心機（TGL20）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；羅氏血糖儀（CR2032）：羅氏診斷產品（上海）有限公司；生物恒溫箱（SHP-80）：上海森信實驗儀器有限公司；全波長酶標儀（Thermo-Multiskan Go）：賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚交配產卵

斑馬魚養殖于多水槽自動循環水系統，水溫保持在28℃，晝夜循環為14 h光照/10 h避光的條件，使用成魚交配產卵前，將雌雄按照1∶1分隔放在同一個交配缸，用擋板隔開，次日早晨將板拔掉，讓其進行交配，收集2 h內所產的魚卵，放在含0.5%亞甲基藍胚胎培養液的培養皿中（每個培養皿放30顆魚卵），每天早晚更換培養液。

1.2.2 建立斑馬魚高血糖模型

在顯微鏡下選取發育正常的5 d齡斑馬魚至6孔板中，每孔30尾，分別浸泡在濃度1%、2%、4%、6%和 8%的葡萄糖溶液及濃度為 0.050、0.100、0.200、0.400 mmol/L和0.800 mmol/L的四氧嘧啶溶液中，空白組浸泡于純水中，于28℃培養箱孵育24 h，統計各實驗組存活率，確定四氧嘧啶和葡萄糖的最適浸泡濃度。以血糖水平為指標，確定四氧嘧啶和葡萄糖處理的條件，建立斑馬魚急性高血糖模型。

1.2.3 NHDC干預條件對急性高血糖斑馬魚的降血糖作用

設置空白組、模型組、不同濃度NHDC組、0.1mg/mL阿卡波糖組，于28℃培養箱孵育16 h后檢測血糖值，確定最佳降糖作用的藥物濃度。

按照相同方法設置空白組、模型組、0.1 mg/mL阿卡波糖組、0.100 mg/mL NHDC組，浸泡20 h，每隔4 h檢測血糖值，觀察記錄其變化趨勢，探討NHDC干預時間對高血糖斑馬魚的降血糖效果。

1.2.4 NHDC處理對斑馬魚糖代謝生化指標的影響

在顯微鏡下選取發育正常的5 d齡斑馬魚至6孔板中，每孔30尾。設置空白組、模型組、0.100 mg/mL NHDC組，處理16 h后采用試劑盒檢測魚體組織中葡萄糖、TG、TC、糖原、胰島素含量。

1.2.5 數據處理與分析

每個實驗平行重復3次，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 25.0及origin 9.0軟件對數據進行處理及繪圖（單因素ANOVA顯著性分析多組數據差異，Student’s t test分析兩組數據差異）。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異較顯著，P＜0.005表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結果與分析

2.1 高血糖斑馬魚模型的建立

對斑馬魚幼魚浸泡在不同濃度四氧嘧啶的存活率進行評價，結果見圖1。

圖1 四氧嘧啶浸泡濃度對斑馬魚存活率的影響Fig.1 Effects of alloxan immersion concentration on survival rate of zebrafish

由圖1可知，5個濃度處理組的存活率分別為98.0%、97.5%、63.5%、0%、0%。在浸泡濃度為 0～0.100 mmol/L時，斑馬魚幼魚的存活率高于97.5%，此時四氧嘧啶對斑馬魚造成的損傷較輕，存活率較高；在浸泡濃度為0.100 mmol/L～0.400 mmol/L時，斑馬魚的存活率與濃度呈負相關，在浸泡濃度為0.200 mmol/L時為63.5%；在浸泡濃度≥0.40 mmol/L時，斑馬魚死亡率高至100%。因此，選擇用于進一步誘導高血糖模型的四氧嘧啶浸泡濃度范圍不超過0.100 mmol/L。

葡萄糖浸泡濃度對斑馬魚存活率的影響見圖2。

圖2 葡萄糖浸泡濃度對斑馬魚存活率的影響Fig.2 Effects of glucose immersion concentration on survival rate of zebrafish

由圖2可知，野生型斑馬魚幼魚分別浸泡在葡萄糖浸泡濃度為1%、2%和4%時，存活率為99.0%；而當浸泡濃度為4%～8%時，隨著葡萄糖浸泡濃度提升，斑馬魚存活率逐漸下降，濃度為6%時存活率僅為73.5%，濃度為8%時存活率為0%。因此，選擇葡萄糖浸泡濃度為4%。

在0～0.100 mmol/L范圍內選擇3個梯度濃度四氧嘧啶和4%葡萄糖聯用浸泡，結果見圖3。

圖3 不同濃度四氧嘧啶和4%葡萄糖聯用對斑馬魚存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of alloxan and 4% glucose combined on survival rate of zebrafish

由圖3可知，四氧嘧啶與葡萄糖兩者聯用濃度為0.050 mmol/L+4%浸泡16 h時存活率為97.5%，16 h后下降，其他聯用濃度在浸泡4h后存活率逐漸下降，當浸泡時間超過12h時，斑馬魚血糖值低于3.9 mmol/L，故采用0.050 mmol/L四氧嘧啶+4%葡萄糖浸泡16 h建立斑馬魚急性糖尿病模型。

由于斑馬魚幼魚體積較小，無法采集血液樣本，因此直接取幼魚魚體勻漿測定血糖含量。以血糖值作為評價指標，0.050 mmol/L四氧嘧啶+4%葡萄糖聯用浸泡16 h后的斑馬魚為高血糖模型組，純水浸泡為空白組，結果見圖4。

圖4 四氧嘧啶與葡萄糖聯用浸泡對斑馬魚幼魚血糖值的影響Fig.4 Effects of combined immersion of alloxan and glucose on blood glucose values of juvenile zebrafish

如圖4所示，模型組血糖值（5.6 mmol/L）與空白組（2.3 mmol/L）差異極顯著（P＜0.005），表明模型建立成功。王澤民[19]使用高膽固醇飲食加上3%葡萄糖溶液浸泡誘導斑馬魚幼魚糖尿病的快速形成，其模型組的葡萄糖值為4.7mmol/L，低于本實驗模型組的葡萄糖值，說明四氧嘧啶+葡萄糖聯用能夠快速建立急性高血糖模型。

2.2 NHDC干預濃度和干預時間對高血糖斑馬魚血糖水平的影響

不同濃度藥物對斑馬魚血糖水平的影響見圖5。

圖5 不同濃度藥物對斑馬魚血糖水平的影響Fig.5 The effects of different concentrations of drugs on blood glucose level of zebrafish

如圖5所示，在干預16 h后，藥物組血糖水平均明顯低于模型組，但相比于空白組，0.025、0.050、0.075 mg/mL 3個劑量組血糖水平仍較高，0.100 mg/mL NHDC組血糖值與空白組相比無差異，與阿卡波糖組相當。前期研究發現，用濃度大于0.1 mg/mL NHDC處理斑馬魚后，其死亡率較高（＞70%），因此選定0.100mg/mL為最佳劑量。勞喬聰[18]通過1.00 mmol/L四氧嘧啶+4%蔗糖聯用浸泡建立斑馬魚糖尿病模型，在阿卡波糖給藥后血糖值明顯低于模型組。丁薇娜[20]的研究表明3'-香葉基柑橘查耳酮（100 mg/kg）給藥后能明顯降低糖尿病小鼠的餐后血糖值，并且降糖作用效果與阿卡波糖（100 mg/kg）相當。阿卡波糖屬于臨床中常見的α-糖苷酶抑制劑，其作用效果為降低糖尿病患者的餐后高血糖[21]，同樣作為柑橘查耳酮的NHDC也具有降血糖作用，與丁薇娜[20]的研究結果一致，因此初步認為NHDC能起到餐后降血糖作用。

NHDC干預時間對斑馬魚血糖水平的影響見圖6。

圖6 NHDC干預時間對斑馬魚血糖水平的影響Fig.6 The effect of NHDC administration time on blood glucose of zebrafish

如圖6所示，從總體上看干預時間為4 h～20 h時，空白組血糖值無明顯變化，模型組血糖水平逐步升高，當斑馬魚在溶液中浸泡4 h時，除空白組外，藥物組血糖值均與模型組無明顯差異，可能由于阿卡波糖及NHDC餐后降血糖作用起效慢，因此干預4 h的降血糖效果并不明顯。0.100 mg/mL NHDC在干預8 h～16 h時間段內血糖值隨著時間的延長穩步下降，且始終低于模型組，到16 h時與空白組無差異，其降血糖效果與阿卡波糖相當。表明NHDC降血糖作用隨著時間的延長而增加，血糖值下降較為穩定，降血糖作用時間長。

2.3 NHDC對高血糖斑馬魚血脂水平的影響

多數糖尿病患者伴有血脂代謝異常[22]，這是因為糖尿病患者胰島細胞分泌胰島素的能力降低，糖代謝紊亂造成脂質代謝發生異常，氨基酸合成脂蛋白酶的能力降低，從而增加了血液當中的脂肪含量，造成血脂異常[23]，通常表現為甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白的升高以及高密度脂蛋白的降低[24]。因此，斑馬魚的葡萄糖、膽固醇和甘油三酯含量可從側面反映血糖的高低[25]。NHDC給藥對斑馬魚葡萄糖含量、TG含量、TC含量的影響見圖7～圖9。

圖7 NHDC給藥對斑馬魚葡萄糖含量的影響Fig.7 The effect of NHDC administration on glucose value of zebrafish

圖8 NHDC給藥對斑馬魚TG含量的影響Fig.8 The Influence of NHDC administration on TG content of zebrafish

圖9 NHDC給藥對斑馬魚TC含量的影響Fig.9 The Influence of NHDC administration on TC content of zebrafish

如圖7～圖9所示，與空白組相比，四氧嘧啶和葡萄糖處理的模型組的葡萄糖含量、TG含量、TC含量均有一定倍數的增加，而NHDC處理后，葡萄糖含量從0.49 mmol/g降至0.16 mmol/g，降低了67.35%，TG和TC含量分別降低了80.88%和55.31%，與模型組相比差異顯著（P＜0.05），因此NHDC能夠有效降低高糖環境誘導的斑馬魚高血脂水平。

2.4 NHDC對胰島素分泌以及糖原合成水平的影響

胰島素是調節血糖的關鍵激素，胰島素與其受體結合后能夠激活胰島素信號通路，抑制糖原合成激酶-3β，并進一步激活糖原合酶（glycogen synthase，GS），通過刺激糖原合成減少肝臟葡萄糖輸出[26]，因此當胰島素分泌減少或生理效應降低會抑制胰島素信號通路下游GS的激活與表達，直接造成糖原含量的降低，進而引發血糖水平的升高。NHDC給藥對斑馬魚胰島素分泌和糖原合成的影響見圖10～圖11。

圖10 NHDC給藥對斑馬魚胰島素分泌的影響Fig.10 The effects of NHDC administration on insulin secretion in zebrafish

圖11 NHDC給藥對斑馬魚糖原合成的影響Fig.11 The effects of NHDC administration on glycogen synthesis in zebrafish

如圖10～圖11所示，四氧嘧啶和葡萄糖處理16 h后，模型組斑馬魚胰島素含量顯著低于空白組（P＜0.05），提示四氧嘧啶和葡萄糖可能造成斑馬魚β細胞功能受損使得胰島素分泌下降，胰島素含量的減少導致其生理效應降低，表現為糖原含量的減少（圖11）。NHDC處理組與模型組相比，胰島素分泌水平和糖原水平分別增加了58%（圖10）和52%（圖11），且與空白組無差異。因此，推測NHDC能夠修復受損的胰島β細胞、刺激胰島素分泌、提高胰島素作用的糖原合成水平，從而降低血糖濃度。

3 討論與結論

四氧嘧啶會選擇性破壞胰腺中產生胰島素的胰島β細胞，是制備糖尿病模型的常用藥物。研究表明，0.050 mmol/L四氧嘧啶和4%葡萄糖浸泡處理16 h造成了幼魚體內糖脂代謝紊亂，表現為血糖、葡萄糖、TG、TC水平的升高，同時β細胞功能受損使得模型組斑馬魚胰島素分泌減少，糖原含量下降。胰島素水平的變化與糖脂代謝和穩態紊亂密切相關，胰島素生理效應降低會影響糖原合成過程，同時也會降低血糖水平。此外，游離脂肪酸是脂肪酸分解過程中生成的功能物質，胰島素生理效應的降低會導致游離脂肪酸生成增加，游離脂肪酸含量偏高會導致高脂血癥，因此模型組糖脂代謝紊亂的發生與胰島素分泌下降有關。而0.100 mg/mL NHDC干預后能夠刺激胰島素分泌，恢復葡萄糖、TG、TC、糖原水平。基于這些研究結果，認為NHDC可能通過修復受損β細胞，增加胰島素生理效應、促進糖原合成來發揮降血糖作用，但其具體降血糖作用的機制還需要再進行更深入的研究。本研究為后期斑馬魚高血糖模型的建立以及黃酮類化合物降血糖作用研究提供了參考，為糖尿病功能食品和治療藥物的開發提供科學依據。