中國主要牧區特色干制發酵乳制品細菌多樣性和游離氨基酸及脂肪酸特征性分析

劉振東，程秀峰，索朗群培，邢書源，李 梁，張金超，羅 章

（西藏農牧學院食品科學學院，西藏特色農產品研發中心，食品科學與工程重點實驗室，西藏 林芝 860000）

發酵是古老的食品加工和保存方法之一，可以追溯到幾千年前[1]。在食品發酵過程中微生物可以提高營養物質的生物利用度，增加防腐保質性能，豐富食品風味，提高食品安全性[2]。干制發酵乳制品既可以使奶類產品長時間保存和遠距離運輸，又能讓乳糖不耐癥患者更容易接受奶制品[3]。干制發酵乳制品獨特的風味和營養特性由5 個因素共同決定：地理和氣候條件、奶源、原料混合物變化、生產工藝和微生物[4]。在這些因素中，細菌對干制發酵乳制品的營養特性起著關鍵作用。

西藏、內蒙、新疆和云南4 個地區均有大量牧民存在，各種各樣的乳制品是牧民的主要生存來源之一[5-8]。干制發酵乳制品是指由原料乳經當地代代相傳的傳統技藝處理，在自然條件下發酵并正常干制而成。曲拉是由脫脂后的牦牛奶在自然條件下發酵凝固并風干制成的粗干制發酵乳制品，屬于西藏自治區典型的手工干制發酵乳制品[9-10]。酸奶疙瘩是由牛奶經自然發酵后自然干制而成，屬于酸奶的結晶體，是新疆牧民自制的典型干制發酵乳制品[11]。奶渣子是將分離出油脂的奶進行發酵，再將其中的水分晾干，屬于內蒙牧區常見的手工干制發酵乳制品之一[12]。乳扇是由牛乳自然發酵并經過凝乳、熱燙、拉伸等工藝而制成，屬于云南典型的干制發酵乳制品[13]。干制發酵乳制品具有蛋白質含量高、益生菌種類多、保存時間長，攜帶方便等特點，在西藏、內蒙、新疆、云南4 個地區被廣泛制作并食用[14]。

傳統基于細菌分離、純化、培養及鑒定的研究方法不易獲得痕量微生物，難以將環境中完整的細菌種群結構及生態關系展現出來[15]，高通量測序技術不僅可以檢測到那些難培養和低豐度的細菌[16]，還可以排除挑選菌株時所產生的單一性，更能代表整體的細菌組成[17]，因此已經逐漸成為研究細菌組成及結構的一種重要方法，近年該技術已廣泛用于原料乳和各類發酵乳等乳制品生態位的研究[18-20]。朱瀟等[21]通過高通量測序技術比較了甘肅藏區傳統牦牛發酵乳制品的細菌菌群多樣性，麻和平等[22]通過高通量測序技術分析比較了不同保存溫度下牦牛酸奶的細菌多樣性，曾椿淋[12]通過高通量測序技術分析了內蒙古不同地區的手工干制發酵乳制品微生物多樣性。然而，通過高通量測序技術分析我國不同省份地區干制發酵乳制品的群落結構和多樣性卻鮮有報道。

本研究分別從西藏、內蒙、新疆和云南4 個地區采集了4 種特色干制乳制品，這4 個地區分別位于中國的西北、西南、北部和南部，屬于中國的邊界省份，而且都盛產奶制品[23]。通過分析4 個地區特色干制發酵乳制品的基本營養成分以及細菌群落多樣性，測定其游離氨基酸和短脂肪鏈酸含量，探討細菌對干制乳制品品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

24 份干制乳制品樣品：新疆的酸奶疙瘩（SNGD）、西藏的曲拉（QL）、內蒙的奶渣子（NZZ）、云南的乳扇（RS），不同地區干制乳制品的采集及分組信息如表1所示，均為2021年3月在農牧民家制作，密封運送至實驗室，于-80 ℃低溫冰箱中保存。

表1 干制乳制品的采集及分組信息Table 1 Information on collection and grouping of dry fermented dairy products

E.Z.N.A.?Soil DNA提取試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；FastPfuDNA聚合酶 北京全式金生物技術股份有限公司；AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 美國Axygen Biosciences公司；MiSeq Reagent Kit v3 美國Illumina公司；鄰苯二甲醛、氯甲酸-9-芴基甲酯、3-巰基丙酸、17 種氨基酸混合標準品（2.5 μmol/mL）、天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、正纈氨酸、色氨酸、21-羥脯氨酸、肌氨酸標準品（均為分析純） 德國Sigma公司；濃鹽酸、硼酸、氫氧化鈉、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉（均為分析純） 廣州化學試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜純）上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

JD-3型電子天平 遼寧省沈陽龍騰電子有限公司；101-2型恒溫干燥箱 上海普瑞賽斯儀器有限公司；KND-04型自動凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器公司；SX2-2.5-12型馬弗爐 北京獨創科技有限公司；N13462C型移液器、5430 R型小型離心機 德國Eppendorf公司；MiFly-6微型離心機 安徽省合肥艾本森科學儀器有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國應用生物系統公司；QuantiFluorTM-ST微型熒光計美國Promega公司；Illumina MiSeq測序儀、Illumina MiSeq PE300型高通量測序儀 美國Illumina公司；QL-901型旋渦混合器 江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TL-48R型粉碎研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀、DB-WAX色譜柱（0.25 mm×50 m，0.25 μm）、1100液相色譜（liquid chromatography，LC）儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本營養成分的測定

根據GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[24]、GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》[25]、GB 5413.5—2010《嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》[26]、GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》[27]、GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[28]的方法測定干制乳制品樣品中脂肪、蛋白質、乳糖、灰分及水分含量。

1.3.2 DNA抽提和PCR擴增

根據E.Z.N.A.?Soil DNA提取試劑盒的說明書進行總DNA抽提，利用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定DNA濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量。使用PCR 以引物對338 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴增16S rRNA基因的V3～V4可變區。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增體系（20 μL）為：4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 5 μmol/L引物，0.4 μL FastPfuDNA聚合酶，10 ng DNA模板。

1.3.3 Illumina MiSeq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST微型熒光計進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300文庫。構建文庫步驟：連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集，氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。利用MiSeq PE300型高通量測序儀進行測序。

1.3.4 脂肪酸的提取及GC-MS分析

參考賈益群等[29]的方法，向離心管中加入1 mL 0.5 mol/L硫酸溶液，加蓋密封，40 ℃、35 kHz超聲振蕩20 min。冷卻后，準確加入4 ℃、1 mL乙醚，用記號筆記下液面位置，劇烈振蕩5 min后，置于冰箱（4 ℃）中靜置放置30 min，補加乙醚至標記刻度，10000 r/min離心5 min，取上層乙醚溶液進行GC-MS分析[30]。混合標準品配制：分別稱量一定質量標準品混合，用丙酮溶解，定容至50 mL，按分析要求稀釋一定倍數后上機測定。

GC條件：進樣口溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；載氣流速1.5 mL/min；分流比3∶1；進樣量1 μL；升溫程序：初始70 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升溫到100 ℃，保持2 min；8 ℃/min升溫到180 ℃，保持0 min；10 ℃/min升溫到250 ℃，保持15 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離能量70 eV；全掃描模式；質量范圍m/z35～550。

實驗結果與美國國家標準與技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）標準譜庫對比分析，確認物質化學結構和名稱，使用特征離子外標法進行定量分析[31]。

1.3.5 游離氨基酸提取及LC分析[32]

將樣品研碎，稱取0.5 g樣品于10 mL離心管中，加5 mL 0.01 mol/L HCl溶液（或純水），混勻，沸水浴30 min，10000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀再加2 mL 0.01 mol/L HCl溶液懸浮超聲5 min，13000 r/min離心15 min，合并上清液，定容至10 mL，過膜測定。

采用安捷倫公司自動在線衍生化方法，一級氨基酸與鄰苯二甲醛、二級氨基酸與芴甲氧羰酰氯衍生后過柱檢測。LC條件：ZORBAX Eclipse AAA色譜柱（4.6 mm×75 mm，3.5 μm）；流動相：A為pH 7.840 mmol/L磷酸二氫鈉；B為乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）；流速1.0 mL/min；梯度洗脫程序如表2所示；在338 nm（0～19 min）、266 nm（19.01～25 min）波長處檢測信號。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同地區干制發酵乳制品基本營養成分分析

脂肪可以影響干制發酵乳制品的硬度、黏性、口感和風味。干制發酵乳制品與其他種類乳制品相比具有高質量蛋白質，含有滿足人體正常生理代謝所需的氨基酸。如表3所示，與其他地區相比，云南乳扇的脂肪含量最高，這可能是因為傳統制作方式中，為延長乳扇貯藏期在制作時添加了植物油[33]。與其他地區相比，新疆酸奶疙瘩的蛋白質含量最高，脂肪含量最低，具有高蛋白低脂肪的特性，這與王絨雪等[34]在新疆地區采集的兩種酸奶疙瘩樣品的研究結果較為相似。此外，西藏曲拉和內蒙奶渣子基本營養成分的各項指標較為接近，這可能與他們極其相似的制作方式有關。乳制品中的營養成分含量隨制作方式、乳品種、所在區域省份及氣候等條件的變化而變化，所以不同地區干制發酵乳制品其脂肪、蛋白質以及乳糖等含量存在一定差異。

表3 不同地區干制發酵乳制品的基本營養成分Table 3 Basic nutrient compositions of dry fermented dairy products from different regions

2.2 不同地區干制發酵乳制品α多樣性分析

α多樣性反映出不同地區乳制品的物種多樣性與豐富度，如表4所示，Illumina MiSeq測序從各區域采集的干制發酵乳制品樣本共獲得2421338 條reads，其中clean reads為1871524 條。由表4可知，云南乳扇中細菌Chao1指數和Shannon指數均明顯高于西藏的曲拉、新疆的酸奶疙瘩以及內蒙的奶渣子，表明云南乳扇中細菌微生物群落的種群差異性相對較大、群落多樣性較高。Chao1指數的結果與Observed OTUs的結果相似，這是因為通常用Chao1算法估計樣品中所含OTUs數目的指數，用來估計物種數，即Chao1指數就是OTUs數的一個反應指標，進一步證明了云南乳扇中細菌微生物群落多樣性以及總體豐度較高。

表4 不同地區干制乳制品細菌多樣性Table 4 Bacterial diversity of dry fermented dairy products from different regions

2.3 不同地區干制乳制品中細菌微生物組成

由圖1 a 可知，4 種干制乳制品的優勢門均為Firmicutes，其中新疆酸奶疙瘩的豐度最高。由圖1b可知，內蒙奶渣子最豐富的科為Streptococcaceae；西藏曲拉的主要科為Lactobacillaceae、Acetobacteraceae、Streptococcaceae和Enterococcaceae；云南乳扇的主要科為Streptococcaceae和Lactobacillaceae；新疆酸奶疙瘩的主要科為Lactobacillaceae和Streptococcaceae。由圖1c可知，內蒙奶渣子和云南乳扇都以Lactococcus為主；西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中最豐富的屬均為Lactobacillus，第二主要屬分別為Acetobacter和Streptococcus。

圖1 不同地區干制乳制品門（a）、科（b）、屬（c）水平各樣本菌群分布圖Fig.1 Distribution of bacterial flora at the level of phylum (a),family (b) and genus (c) in dry fermented dairy products from different regions

通過LEfSe分析，以前6 個特征菌為代表，由圖2可知，內蒙奶渣子的特征菌有Lactococcus、Streptococcaceae、Enterobacteriaceae、Enterobacteriales、Serratia和Halomonadaceae。西藏曲拉代表性細菌微生物有Rhodospirillales、Alphaproteobacteria、Acetobacteraceae、Acetobacter、Proteobacteria和Enterococcaceae。云南乳扇中的特征菌有Gammaproteobacteria、Pseudomonadales、Rahnella、Moraxellaceae、Archaea和Neisseriaceae。新疆酸奶疙瘩中，鑒定出了Lactobacillaceae、Lactobacillus、Firmicutes、Lactobacillales、Bacilli和Streptococcus。

圖2 不同地區干制乳制品LEfSe分析圖Fig.2 LEfSe analysis of dry fermented dairy products from different regions

2.4 不同地區干制乳制品中脂肪酸分析

脂肪酸在干制乳制品風味中起著重要作用，它們能抑制致病菌的生長，促進益生菌的生長。高乙酸含量會導致干制乳制品的不良風味，通過對16 種脂肪酸的評價，乙酸含量與總脂肪酸含量相比較少（表5）。由表5可知，云南乳扇中的16 種脂肪酸均高于其他3 個地區，丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸和硬酯酸含量最為明顯。這可能與云南乳扇的生產工藝有關，制作過程中會將木瓜提取的酸水加入鮮奶中，酸和熱加速了奶的凝固，酸水在一定程度上引入了系列復合酶，從而引發系列水解反應，導致乳扇中有相對較多的脂肪酸類物質。云南乳扇中的棕櫚酸含量最高，棕櫚酸穩定性比較好，可以用來增加食品的色澤，所以乳扇的外表光滑、色澤油亮。內蒙奶渣子、西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩的硬酯酸含量最高，硬脂酸是脂肪酸的重要成分，能迅速轉化為單不飽和脂肪酸油酸。此外，共軛油酸也是干制發酵乳制品脂肪中的有益成分，具有抗癌、抗脂肪形成、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病和抗炎等多種生物活性，適量攝入對人體健康有益。

表5 不同地區干制乳制品中的主要脂肪酸Table 5 Major fatty acids in dry fermented dairy products from different regions

2.5 不同地區干制乳制品中游離氨基酸分析

干制乳制品中的游離氨基酸有助于風味的形成，可作為分解代謝反應的前體產生酮酸、氨、胺、醛、酸和醇，從而產生干制乳制品的風味和香氣。由表6可知，共檢出24 種游離氨基酸，新疆酸奶疙瘩的游離氨基酸種類最為豐富，包含了24 種游離氨基酸，而且多數游離氨基酸含量高于其他3 個地區的干制乳制品，因為新疆酸奶疙瘩的蛋白質含量與其他3 個地區的干制發酵乳制品相比最高（表3），而乳制品在發酵過程中通過酶的作用可以使蛋白質分解產生氨基酸。其中，谷氨酰胺、組氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸只存在與新疆酸奶疙瘩中，所以新疆酸奶疙瘩的風味最為豐富。在4 個地區不同的干制乳制品中，只有內蒙奶渣子不含纈氨酸，西藏曲拉不含酪氨酸。干制發酵乳制品中氨基酸的存在對其質量與風味都有直接作用，精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸主要呈現苦味，谷氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸具有酸味，丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸具有甜味[35]。

表6 不同地區干制乳制品中的游離氨基酸Table 6 Free amino acids in dry fermented dairy products from different regions

2.6 細菌微生物群落與脂肪酸和游離氨基酸的關系

利用RDA研究細菌微生物群落與α多樣性、脂肪酸和游離氨基酸的關系，如圖3所示，RDA1和RDA2分別占總方差的44.31%和22%。在西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中，丙氨酸與醋桿菌Acetobacter、乳桿菌Lactobacillus和鏈球菌Streptococcus相關。在云南乳扇中，高含量的乙酸和丁酸與Acinetobacter相關，同時，羥脯氨酸也與Acinetobacter相關。因此，不同地區干制發酵乳制品中的微生物群落與其風味和營養成分息息相關。

圖3 細菌微生物群落與脂肪酸和游離氨基酸的RDAFig.3 RDA plot showing the relationship of bacterial communities with fatty acids and free amino acids

3 討論

內蒙的奶渣子、西藏的曲拉、云南的乳扇和新疆的酸奶疙瘩的基本營養成分和細菌微生物豐富度和多樣性均存在一定差異。其中，與其他地區相比，云南乳扇中水分含量和細菌微生物群落多樣性以及總體豐度最高，這可能與云南乳扇獨特的制作方式以及較多的環境微生物有關。首先，云南乳扇是鮮牛乳巴氏殺菌后，充分凝乳形成凝塊后進行熱燙洗滌，然后借助木桿將其拉伸成獨特的紙扇形狀上架晾干而制成，制作工藝相對復雜，制作流程相對較多[36]，與環境的接觸更為密集。其次，云南是中國的旅游大省，流動人口遠高于新疆、西藏和內蒙3 個地區[37]，環境微生物相對于其他地區更加復雜多樣。

內蒙的奶渣子、西藏的曲拉、云南的乳扇和新疆的酸奶疙瘩都含有Lactobacillus、Lactococcus和Streptococcus，這些細菌利用乳糖和其他碳水化合物、脂肪、蛋白質和肽，產生短肽、游離氨基酸、脂肪酸和芳香化合物，在風味形成和營養成分中發揮重要作用[38]。Lactococcus是中國傳統干制發酵乳制品和西方干制發酵乳制品的主要菌屬[39]。本研究中，云南乳扇和內蒙奶渣子中Lactococcus的含量最高，西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中最豐富的屬為Lactobacillus。Lactobacillus所表達的酶能夠分解苯丙氨酸和酪氨酸，從而產生芳香化合物，使西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩散發出特殊的香味[40]。在RDA圖中，Acinetobacter增加了云南乳扇中的丁酸含量，丁酸由微生物代謝產生，與病理性疾病有關。丁酸作為主要能量來源被結腸上皮吸收，從而增強腸道屏障功能[41]。而且只有云南乳扇中含有丙酸，丙酸參與了干制乳制品特有風味的形成，對Salmonella、Escherichia、Listeria monocytogenes等病原菌也有抑制作用[42]。因此，云南乳扇可能比內蒙的奶渣子、西藏的曲拉和新疆的酸奶疙瘩更健康。一般而言，干制發酵乳制品脂肪中含有66%的飽和脂肪酸、30%的單不飽和脂肪酸，硬脂酸和棕櫚酸是干制乳制品飽和脂肪酸的重要組成部分[43]，所以4 個牧區的傳統干制發酵乳制品的硬脂酸和棕櫚酸含量較高。綜上所述，不同的加工工藝導致4 個牧區傳統干制發酵乳制品的微生物組成不同，這可能會影響微生物代謝產生的氨基酸和脂肪酸的含量，從而導致營養成分和風味的差異。

不斷增加的人類活動，包括工業化、城市化、人口、旅游業和其他變化，可以改變近地表大氣中環境微生物的數量和類型[44]。內蒙的奶渣子、西藏的曲拉、云南的乳扇和新疆的酸奶疙瘩是中國4 個牧區的傳統干制發酵乳制品，沒有添加發酵劑乳酸菌。與大多數西方干制發酵乳制品不同的是，它們的細菌微生物幾乎完全來自環境。結果表明，奶渣子、曲拉、乳扇和酸奶疙瘩可作為研究中國不同地理區域與環境微生物關系的指示性案例。在4 個牧區中，乳扇的細菌微生物群落顯著豐富，其次是奶渣子和酸奶疙瘩，最后是曲拉。因為，曲拉產于西藏，西藏的生態環境質量最好，工業化、城市化和人口規模最小，這反映了云南乳扇可能比其他3 種干制發酵乳制品受到更多的環境污染。這種污染在干制發酵乳制品生產過程中普遍存在，應該在進一步研究干制發酵乳制品細菌微生物群時加以考慮。

眾所周知，微生物在發酵過程中對風味代謝產物的特性起著至關重要的作用。此外，干制發酵乳制品成熟過程中復雜的微生物組成與多種代謝物的形成有關，這是干制發酵乳制品風味多樣化的潛在工具[45]。本研究測定了干制發酵乳制品樣品中24 種游離氨基酸的含量，其中酸奶疙瘩中多數氨基酸的含量高于乳扇、曲拉和奶渣子。芳香氨基酸、支鏈氨基酸和含硫氨基酸等游離氨基酸的產生，是干制發酵乳制品獨特風味和香氣的形成因素[46]。同時，乳扇生產地區丁酸含量最高、人口最多。丁酸不僅是一種益生菌，也是干制發酵乳制品的一種香味。研究表明，陳年干制發酵乳制品的味道非常濃郁，這可能與丁酸有關[47]。綜上所述，地理區域與人口、旅游等人類活動相結合，可能會影響干制發酵乳制品的細菌微生物豐富度、多樣性、組成以及干制發酵乳制品的風味。

4 結論

采用國標中的系列方法對基本營養成分進行測定，利用高通量測序技術，對中國4 個主要牧區特色干制發酵乳制品的細菌微生物群落結構進行分析，同時測定游離氨基酸和脂肪酸的含量并對其進行RDA。研究表明，云南乳扇中水分含量和細菌微生物多樣性最高，脂肪含量和16 種脂肪酸含量均高于其他3 個地區。新疆酸奶疙瘩的蛋白質含量和游離氨基酸種類最為豐富，檢測到24 種游離氨基酸，而且多數游離氨基酸含量高于其他3 個地區的干制發酵乳制品。在4 個地區不同的干制發酵乳制品中，只有內蒙奶渣子不含纈氨酸，西藏曲拉不含酪氨酸。在西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中，丙氨酸與Acetobacter、Lactobacillus及Streptococcus相關。由此可見，不同的地理位置和環境條件會在很大程度上改變細菌微生物的數量和種類，導致干制發酵乳制品中細菌微生物的分布和化學成分不同。本研究為我國各省份傳統干制發酵乳制品的工業化生產提供了一定理論支持。