中性粒細胞胞外誘捕網在類風濕關節炎發病機制中的研究進展

宋子怡 張升校 蘇勤怡 李小峰

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性的、以累及關節為主的多系統自身免疫性疾病,病變早期關節主要病理特征為滑膜炎細胞浸潤、滑膜增生和血管翳形成,晚期常發生關節畸形。RA患者外周血和滑膜液中存在特異性自身抗體,如抗瓜氨酸蛋白抗體(autoantibodies to citrullinated protein antigens, ACPAs)、抗氨甲酰化蛋白抗體及抗乙酰化蛋白抗體等[1]。其中ACPAs最為關鍵,在RA亞臨床階段可在血液中存在數年。中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps, NETs)是RA中瓜氨酸蛋白的重要來源,能刺激機體產生ACPAs。此外,NETs還能與滑膜成纖維細胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)相互作用導致炎性反應增強。本文將重點概述NETs在RA發病機制中的關鍵作用及以NETs為靶點的藥物在RA治療中的新進展。

一、NETs的形成

NETs是中性粒細胞受到感染或炎癥等刺激后失去細胞內膜完整性后釋放的一種染色質纖維網狀結構,主要成分為組蛋白、DNA和顆粒蛋白,網上分布的各種酶及抗菌肽可捕捉、固定并殺滅侵入機體的細菌。2004年,Brinkmann等[2]發現并報道了NETs,這是一種殺菌的新機制。NETs的形成與清除失衡與許多自身免疫性疾病的發生有關。

活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)介導了NETs的形成,其產生包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶(NADH oxidase, NOX)依賴途徑與NOX非依賴途徑[3,4]。在NOX依賴途徑中,在微生物、血小板、免疫復合物(immune complexes, ICs)、自身抗體、細胞因子、藥物、體外的蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的強效激活劑乙酸肉豆蔻佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)和鈣離子(Ca2+)等多種因素的刺激下,中性粒細胞被激活,其細胞膜上的NOX2進而產生ROS,ROS作用于嗜苯胺藍顆粒(azurophilicgranules, AG),導致髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和中性粒細胞彈性酶(neutrophil elastase, NE)從AG轉移到細胞核,這兩種酶在細胞核中促使組蛋白分解和染色質解聚,隨后中性粒細胞膜破裂,NETs形成[5,6]。在NETs形成過程中,激活的中性粒細胞能進一步誘導大量的肽酰基精氨酸脫亞胺酶(peptidylarginine deiminase, PAD)4產生,使組蛋白瓜氨酸化。在NOX不足時,線粒體可通過NOX非依賴途徑產生ROS,促使NETs形成。刺激NETs形成的信號通路目前尚未完全明確,Raf-MEK-ERK可能起著關鍵性的作用。此外,有研究表明,NETs的形成與G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)和整合素等信號分子有關[7]。

中性粒細胞產生NETs并伴隨細胞裂解、死亡的過程稱為NETosis,是一種在形態學上不同于凋亡和壞死的新的細胞死亡方式[8]。NETosis的發生因刺激類型的不同分為自殺性和非自殺性。前者如上所述,最為常見,可在中性粒細胞受刺激后數小時內發生。后者則可在中性粒細胞受刺激后幾分鐘內發生,由金黃色葡萄球菌通過Toll樣受體(toll-like receptors, TLR)2配體和補體受體或由大腸桿菌通過TLR4或TLR4激活的血小板誘導產生[9]。與自殺性NETosis一樣,NE轉移到細胞核中,促進染色質進一步解聚和核膜破壞,被蛋白質修飾的染色質通過小泡排出胞外。不同的是,中性粒細胞膜不被破壞且保留了趨化、吞噬、殺菌等功能。

二、NETs介導RA的發病機制

在生理狀態下,NETs可對外界的危險信號產生防御反應。NETs可結合多種病原體并釋放高濃度的抗菌物質以降低細菌毒力并殺死細菌,從而保護機體。然而,在慢性感染和炎性反應時,NETs可介導自身免疫反應并直接殺死上皮細胞和內皮細胞,導致組織充血、水腫及氧化損傷,促使RA發生、發展[10]。

RA發展過程中常有NETs的清除異常[11]。脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonucleaseⅠ, DNaseⅠ)是一種主要存在于血液和胃腸道中具有核酸內切酶活性的酸性糖蛋白,是NETs的重要降解因子。DNaseⅠ可能通過抑制ROS的產生從而減少NETs形成及促進已形成NETs降解發揮作用,但具體機制尚不清楚。研究發現,RA滑膜中的DNaseⅠ中幾乎無活性,血清中的DNaseⅠ活性顯著降低,且與紅細胞沉降率(erythrocytesediment rate, ESR)、C反應蛋白(C reactive protein, CRP)和中性粒細胞計數等炎性指標呈負相關。因此,血清DNaseⅠ活性水平也許能作為評價RA活動性的指標[12]。DNaseⅠ的活性受損會導致NETs不能被有效清除,進而增加瓜氨酸化自身抗原的暴露,增加ACPAs的產生,導致關節炎癥進一步惡化。

RA患者滑膜組織、類風濕結節和皮膚組織中有大量NETs的存在,對激活中性粒細胞的刺激因素更加敏感。外周血中NETs的百分比與血清CRP、ESR、ACPAs和IL-17水平也呈顯著正相關[13]。NETs通過產生瓜氨酸蛋白等自身抗原、與環境因素相互作用誘導ACPAs產生以及促進滑膜成纖維細胞增殖和產生細胞因子等機制介導RA的自身免疫應答。

1. NETs是瓜氨酸蛋白等RA自身抗原的主要來源:RA患者在亞臨床階段體內即可出現自身抗原,其中瓜氨酸化組蛋白是RA中主要的抗原。在中性粒細胞形成NETs并殺滅病原體的過程中,組蛋白的瓜氨酸化是關鍵一步。瓜氨酸化是一種蛋白質翻譯后的修飾過程,指蛋白質肽鏈中蛋白的精氨酸殘基在PADs作用下脫亞氨基轉化為瓜氨酸化蛋白。PADs包含5種同工酶(PAD1～4和PAD6),中性粒細胞廣泛表達PAD2與PAD4。正常情況下PAD4無活性,但在氧化應激或自身免疫反應過程中,Ca2+進入細胞使其活化,導致組蛋白、彈性蛋白酶、天青蛋白和髓樣細胞分化抗原等瓜氨酸化,增加了它們的抗原性[4]。此外,穿孔素和補體膜途徑能使中性粒細胞形成孔隙,通過增加細胞內鈣離子濃度激活PADs,使中性粒細胞蛋白廣泛瓜氨酸化[14]。瓜氨酸化蛋白能刺激機體產生ACPAs,從而誘導自身免疫反應。RA患者外周血中NETs與ACPAs水平具有相關性,當ACPAs從血漿中清除時,抗NETs抗體的活性也降低[15]。反過來,ACPAs也能刺激中性粒細胞釋放NETs,使炎癥持續發生,形成惡性循環。此外,NETs形成過程中產生的與RA發病相關的自身抗原還有膜聯蛋白A1、過氧化氫酶、基質相關蛋白酶8等。

2. 環境因素通過NETs誘導ACPAs產生促使RA發病:RA發病早期,一些環境因素如吸煙和牙周病感染都能以依賴PADs的方式形成NETs并產生瓜氨酸蛋白,進而誘導ACPAs產生[16]。隨后,瓜氨酸化蛋白可與相應的自身抗體結合形成ICs,在ICs刺激下,關節滑膜炎性反應持續進展,最終導致關節組織破壞及畸形。NETs中的瓜氨酸蛋白產生后進一步誘導NETs的形成,形成正反饋。據報道,在健康吸煙者的支氣管肺泡灌洗液中,PADs酶的表達和活性升高,瓜氨酸化蛋白水平也升高,可能與煙草中的尼古丁有關。一些臨床證據表明,在RA亞臨床和臨床階段,ACPAs陽性患者常伴有支氣管擴張、間質性肺疾病和小氣道阻塞等呼吸系統疾病[17]。牙齦卟啉單胞菌會引起牙周炎,并在高度血管化的環境中產生瓜氨酸抗原。放線菌團聚桿菌是一種革蘭陰性桿菌,可引起牙周炎和感染性心內膜炎,通過產生白細胞毒素a來觸發中性粒細胞整體高脂化,它也能夠通過誘導ACPAs產生導致RA發生,但具體機制尚不明確[18]。

3. NETs通過促進滑膜成纖維細胞增殖和產生細胞因子加重RA關節損害:RA滑膜微環境非常有利于形成NETs。FLSs是促進關節滑膜增生的主要細胞,可吸引炎性細胞作用于滑膜,加劇關節炎癥及組織破壞。NETs的瓜氨酸蛋白可作為自身抗原激活滑膜中的免疫細胞,刺激FLSs或巨噬細胞表達和釋放IL-8、IL-6和IL-25等促炎性細胞因子,這些炎性細胞因子和多種抗體又可以誘導NETs產生,導致機體免疫耐受喪失,促進RA的發展。RA-FLSs可將NETs內化至晚期糖基化終產物受體-TLR9途徑中。這種由FLSs內化的NETs可使FLSs合成更多的促炎性細胞因子和趨化因子,并通過主要組織相容性復合體Ⅱ使FLSs具有抗原遞呈細胞能力[19]。FLSs可以將含有瓜氨酸肽的NETs遞呈給RA抗原的特異性T細胞并激活它們,從而介導適應性免疫反應。研究表明,NETs在體外能促進RA-FLSs增殖并使RA-FLSs內CTGF mRNA表達上調和MST1激酶表達顯著下調[20]。Khandpur等[13]研究結果表明,NETs對FA-FLSs的影響可能與RA患者滑膜中DNaseⅠ活性受損有關。

4. NETs介導RA發展的其他可能機制:除了上述機制外,NETs還可通過產生PAD2、排出線粒體DNA(mtDNA)、促進血管新生和血管翳的形成、激活補體系統等加劇RA炎癥。NETs中的PAD2不僅可以直接降解滑膜中的軟骨成分,還能激活FLSs和巨噬細胞的促炎途徑,從而加劇關節損傷。目前,大多數研究者認為,NETs有細胞核及線粒體兩種來源,但仍未進一步明確。NETosis期間,中性粒細胞排出的mtDNA具有促炎特性,這一發現增加了NETs介導的自身免疫的復雜性。由于mtDNA含有細菌核酸的殘體,且存在異常甲基化,因此,機體可能產生對mtDNA的免疫反應,增強TLR信號和放大炎癥信號而誘發RA[21]。RA滑膜中明顯增多的NETs可以促進血管新生,但這一過程的分子機制有待于進一步研究。此外,NETs結合相關抗體后,可通過經典途徑激活補體系統進一步加重炎性反應[22]。

三、以NETs為靶點在RA中的潛在療法

NETs在RA發病早期發揮了重要的促炎作用,多種藥物可通過調控NETs靶點治療RA。研究表明,托珠單抗和利妥昔單抗等能通過減少NETs的生成延緩RA進展[23]。雷公藤不僅可以減少健康人和RA患者的NETs,還能通過抑制氧化爆發和脾酪氨酸激酶的活化阻止絲裂原活化蛋白激酶、細胞外信號調節激酶、活化核轉錄因子κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)的磷酸化減少NETs中組蛋白的瓜氨酸化,從而延緩RA進展。另外一些研究表明,抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)可以通過阻斷T淋巴細胞mTOR受體阻止NETs的形成和ROS的釋放降低RA等自身免疫性疾病的活動性。PAD4抑制劑CL-脒(CI-amidine)可通過減少小鼠關節和血清中的瓜氨酸蛋白和IL-6減輕關節損害,但效果欠佳。DNaseⅠ可促進NETs的清除從而減輕小鼠腎臟組織損傷并延長壽命。GSK199作為一種低鈣PAD4酶抑制劑也可減緩關節炎嚴重程度。由此可見,靶向中性粒細胞產生的NETs可能成為改善RA患者預后的新的治療靶點,針對其產生機制有望開發新的靶向藥物。

四、展 望

中性粒細胞及其產生的NETs大量存在于RA的炎癥部位,在自身免疫反應的發生和發展過程中起著至關重要的作用。RA的發生、發展與NETs生成能力的增加以及導致持續性炎癥和組織損傷的NETs清除障礙有關。NETosis會導致細胞內翻譯后修飾的蛋白質和DNA暴露,從而打破自身免疫耐受并激活適應性免疫反應,誘導免疫細胞產生自身抗體和細胞因子等,并直接激活鄰近細胞,誘導組織損傷并導致全身炎性反應,促使RA發生。NETs還可以通過激活補體途徑等方式放大炎性反應。本研究概述了可用于預防NETs生成或增加其降解的可能靶向藥物,但仍需要對這些藥物進行更多的研究和臨床試驗以證實其療效,從而減輕對RA患者的傷害。進一步探索NETs影響RA的發病機制將為NETs成為具有診斷意義的生物學標志物和靶向NETs治療RA提供堅實的基礎。