慢性難愈合創面“缸口”的形成機制和中醫藥治療研究進展

馬慧可 李 萍 陳 佳 林 燕 姚文濤 何秀娟

慢性難愈合創面是指因多種內在或外界因素導致創面長期處于潰爛、滲出或呈纖維化狀態,不能按時完成正常的上皮化和及時的組織與功能修復,治療4周后仍愈合緩慢或無明顯愈合傾向的傷口[1]。慢性難愈合創面主要包括感染性潰瘍、放射性潰瘍、創傷性潰瘍、癌性潰瘍、動靜脈潰瘍以及皮片或皮瓣移植術后的壞死創面等[2]。慢性難愈合創面的發病機制包括慢性或過度炎癥、修復細胞增殖受阻、局部高酶活性、氧化應激損傷以及生長因子分泌不足等[3]。“缸口”是指潰瘍長期難以愈合,瘡口下陷不收、邊緣高突增厚,皮緣形如大缸環口之狀。“缸口”形成多發生在創面修復的重塑期,表皮與真皮未能同步恢復,表皮缺損部位愈合過快或角質形成細胞積聚過多導致上皮變硬變厚,創面形成“缸口”,從而導致傷口愈合延遲。臨床研究發現“缸口”是導致慢性難愈合創面的重要影響因素,缸口的深度與臨床療效密切相關。動物研究發現,創緣與創面之間形成的角度越大,越有利于局部炎性滲出物引流、傷口收縮以及肉芽組織中纖維母細胞與新生毛細血管的生長。創緣與創面形成的角度過小的潰瘍,臨床上多將創緣皮膚適當切除,一方面有助于改善炎性滲出物在創面的引流與其在上皮處的過度積聚,從而促進上皮細胞的爬行,另一方面有助于創面暴露出更多的真皮組織,以改善遲滯的上皮組織的生長與創面局部的氧分壓,從而促進缺損組織的良性修復。因此,臨床上及時并有效的處理創緣在極大程度上促進了慢性皮膚潰瘍的愈合。

一、EMT過度導致慢性難愈合創面“缸口”形成

傷口的愈合過程經歷止血期、炎癥期、增殖期和重塑期,4個階段必須相互協調,且以正確的時間和順序整合以實現正常的創面修復[4]。在皮膚創面修復的增殖期和重塑期,表皮修復從創口邊緣開始,涉及角質形成細胞的激活、遷移和增殖以覆蓋新生肉芽組織,從而形成新生表皮并恢復表皮屏障功能,該過程被稱為再上皮化,這也是傷口愈合過程中的關鍵階段[5, 6]。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表現為細胞上皮特性逐漸丟失而表現出間質的特性,細胞運動和遷移能力增強[7]。上皮特性的改變主要在于上皮細胞失去其原有的“上皮形態”,包括細胞-細胞間、細胞-外基質間和細胞-基底膜間的連接減弱,細胞極性消失,同時上調Slug、Snail1、Snail2、Zeb1和Twist等EMT相關基因。EMT可分為3型:Ⅰ型EMT參與胚胎生成和器官發育;Ⅱ型EMT參與創面愈合、組織再生和器官纖維化;Ⅲ型EMT參與腫瘤形成和轉移[8]。其中,Ⅱ型EMT完全由損傷和炎癥引起,一旦創面達到修復狀態或炎癥消退便會停止EMT的發生。在再上皮化過程中,皮膚創緣的角質形成細胞發生脫黏附,細胞骨架重排而變得疏松;這些改變同時使靜止的角質形成細胞伸出板狀偽足,實現細胞遷移[9]。再上皮化完成后,角質形成細胞會恢復上皮細胞表型,重建緊密的細胞連接和屏障功能,因此,再上皮化過程中的部分EMT是可逆的。在創面愈合早期,EMT來源的肌成纖維細胞可以通過分泌細胞外基質和收縮傷口床來縮小創面[2]。但是在創面愈合晚期,如果炎癥持續刺激導致EMT無法及時消退,則會導致瘢痕形成。研究表明,轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)是發生EMT的誘導因子,EMT在皮膚創面愈合過程中參與炎性反應,促進成纖維細胞與血管增生,調節膠原合成等[10]。因此,其對于適當的上皮化和細胞外基質沉積是必要的,但持續的從上皮細胞到肌成纖維細胞的過度轉化將導致纖維化[9]。

在皮膚創面愈合過程中,創緣上皮細胞遷移增強,細胞間黏附降低,角質形成細胞通過增殖、遷移驅動再上皮化,成纖維細胞介導局部結締組織收縮,促進創面邊緣閉合[11]。再上皮化是創面愈合的關鍵組成部分,因此,參與再上皮化的角質形成細胞是創面修復的主要參與者[12]。創面中的角質形成細胞通過細胞間黏附減少、細胞骨架蛋白重組以及基因重編程轉換為具有間充質表型的細胞,從而實現再上皮化以恢復表皮屏障,這一過程是創面愈合的基礎[8]。波形蛋白(Vimentin)和N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的增多以及E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的減少可作為判斷EMT發生及其進展程度的標志[11]。在細胞極化條件下,E-cadherin與相鄰細胞結合,形成上皮屏障的細胞間復合物,在相鄰細胞的細胞骨架之間形成橋梁。EMT轉錄因子(如Snail、Slug和Twist)與E-cadherin啟動子區E-boxs結合,下調E-cadherin來實現EMT[13]。然而,失去E-cadherin的細胞則不能相互黏附,因此E-cadherin表達水平的改變是判斷細胞遷移、腫瘤浸潤轉移與否的重要標準。Snail與同一家族Slug可通過抑制E-cadherin來調節上皮再生過程中的角質形成細胞運動,減少細胞間黏附來實現EMT[9]。細胞骨架在經歷特征性重組過程中,肌動蛋白介導應力纖維形成,以細胞角蛋白(cytokeratin, CK)為主的細胞骨架轉變為以Vimentin為主的細胞骨架,調節細胞運動并發生EMT[14]。經EMT轉化的細胞MMP2和MMP9上調,降解細胞外基質并促進細胞遷移。此外,局部降解的細胞外基質還會釋放儲存的生長因子如TGF-β1,促進細胞間充質表型的獲得、侵襲和轉移,進一步加強EMT[15]。

創面愈合過程中的EMT受到成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、肝細胞生長因子和TGF-β等多種信號通路的精細調節[16]。TGF-β調控細胞增殖、遷移、分化以及EMT,參與損傷修復和致纖維化。TGF-β超家族中TGF-β1與致纖維化密切相關。在慢性創面中,炎性巨噬細胞可分泌TGF-β1,刺激成纖維細胞增殖和合成細胞外基質,而皮膚創面邊緣纖維化是慢性創面的重要發病機制[17]。TGF-β信號通路經Smad依賴型和Smad非依賴型通路發揮作用。TGF-β/Smad信號通路中,TGF-β配體結合TGF-βR1、TGF-βR2導致Smad2和Smad3磷酸化,之后與Smad4形成復合物并易位至細胞核,反式激活編碼ECM、基質金屬蛋白酶、結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)和Snail基因的表達,最終促進EMT的形成[18]。同樣,骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)可結合TGF-β受體導致Smad1和Smad5磷酸化,也與Smad4形成復合物。同時,抑制性Smad6和Smad7也與Smad2和Smad3競爭性結合TGF-βR1[19]。這些Smad復合物(Smad2-Smad3-Smad4和Smad1-Smad5-Smad4)遷移到細胞核,并作為轉錄因子調節間充質狀態相關基因的表達[18]。研究發現,TGF-βR1/TGF-βR2、Smad2-Smad3-Smad4失活均可以阻斷TGF-β1誘發EMT。雖然Smad3可以誘發EMT,但Smad2可以抑制TGF-β1誘發EMT,并且Smad2缺陷的角質形成細胞通過增強Smad3和Smad4活性而發生EMT。因此,TGF-β是致纖維化的主要調節因子。

創傷修復與腫瘤發生均有細胞增殖與分化、組織重塑與炎性反應等過程的參與,并且涉及多條共用信號通路。2020年《Nature》報道,TGF-β通過RAS反應元件結合蛋白1(RAS responsive element binding protein 1, RREB1)協調EMT過程和纖維化[20]。TGF-β是EMT過程和纖維化的有效誘導因子,其依賴于迅速加速性肉瘤蛋白(rapidly accelerated sarcoma,RAS)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)通路來誘導EMT發生。RREB1和RAS轉錄效應子是EMT中TGF-β激活的Smad轉錄因子的關鍵伴侶,之后被MAPK激活以促使Smad被募集Snail,最后經染色質可極性誘導產生EMT。在癌細胞中,TGF-β/Smad和RREB1直接驅動Snail,促進腫瘤內纖維化。因此,RREB1促進RAS和TGF-β通路間的相互聯系,誘導EMT過程和纖維化。

RREB1編碼的蛋白是一種轉錄因子,參與細胞增殖、轉錄調控和DNA損傷修復等生物過程,能結合下游基因啟動子區的Ras 反應元件(RAS-responsive elements,RRE)發揮作用,被認為是RAS/RAF信號通路轉導的一個效應分子。RREB1基因位于人類6號染色體(6p25),全長144kb,編碼的蛋白是具有15個鋅指結構域的轉錄因子,目前已知存在12個異構體[21]。RREB1能誘導降鈣素、p53、FSH等基因的轉錄,抑制血管緊張素原、p16、hZIP1、PSA、HLA-G等基因的轉錄。RREB1和雄激素受體、C-Terminal結合蛋白等核蛋白相結合,并參與microRNA、lncRNA、circularRNA等的調控。在實體腫瘤中RREB1與細胞遷移運動有關。MCF10A乳腺上皮細胞敲低RREB1后細胞的遷移與表面活性受到抑制,從而形成緊密的細胞集落[22]。因此,RREB1減少細胞間黏附促使細胞遷移,而RREB1低表達可通過抑制細胞遷移,在抗纖維化與抗腫瘤方面發揮重要作用。因此,慢性皮膚潰瘍局部炎癥持續存在,RREB1可能促進TGF-β/Smad和RAS/MAPK信號通路協同誘導EMT過程導致EMT過度甚至纖維化,是“缸口”形成的機制。

二、中醫藥抑制TGF-β/Smad和RAS/MAPK信號通路對EMT過度以及“缸口”的研究

慢性皮膚潰瘍屬中醫“瘡瘍”范疇,中醫藥治療瘡瘍顯示了強大的生命力。瘡瘍的形成經歷初起(初期)、成膿(中期)、潰后(膿成)3個階段,總則為早期為消,中期為托,后期為補。顧筱巖認為,若臁瘡經久難愈,瘡面凹陷,瘡周紫黑,質地僵硬,有如“缸口”之狀,僅用生肌之法,則肉芽浮起而致新肉不生;若局部采用墊棉壓迫法,可使肉芽平伏,并配合纏縛療法,用布綁扎小腿,利于氣血暢通,促進瘡面愈合,日久便可見效[23]。創面愈合增殖期階段的潰瘍創面肉芽色淡白,瘡周紫滯,致缸口形成,久不收斂,斂后復潰,管壁粗硬。鄭勇等[24]采用祛瘀生肌法,主張舊瘀宜通滯,因此在補陽還五湯之基礎上加用蟲類藥材,如水蛭取搜剔絡邪之功。水蛭善入則堅積易破,借其力以攻積久之滯,自有得而無害也。瘡面愈合重塑期階段,瘡周形成較厚硬且彈性差的灰白組織,形成“缸口”,阻礙新生上皮組織在瘡面的爬行,從而形成慢性難愈合瘡面。闕華發[25]認為,瘡周有潛行性空腔時,采用墊棉療法墊壓空腔處,再以繃帶加壓纏縛,壓緊患處,可促進皮肉黏合,利于創面愈合。對于“缸口”的處理,闕華發[25]認為可采用煨膿濕潤法,油膏厚敷創面厚硬組織,待其軟化后機械清除,并外敷生肌斂瘡藥膏,可促進上皮生長,加速瘡面愈合。

TGF-β/Smad和RAS/MAPK信號通路誘導EMT過度導致慢性慢性難愈合創面“缸口”形成。中藥復方或中藥提取物可在創面愈合早期階段上調TGF-β或TGF-β/Smad信號通路來促進創面愈合,但其在創面修復后期通過抑制EMT過度來促進創面修復的具體機制還有待于深入研究。張臻等[26]用益氣化瘀方灌胃糖尿病大鼠,抑制TGF-β/ALK5/Smad2/3信號通路,促進糖尿病大鼠創面愈合并減少瘢痕形成。王振宜等[27]將復黃生肌愈創油膏外用于糖尿病大鼠,在創面修復晚期,下調TGF-β、Smad3表達,上調Smad7表達,促進創面愈合的同時阻止成纖維細胞過度增殖與遷移,從而減少瘢痕形成。孫桂芳等[28]將生肌玉紅膏體外干預人增生性瘢痕成纖維細胞(hurean hyportrophic scar fibroblast, hHSF),抑制hHSF增殖、α-SMA和Ⅰ、Ⅱ型膠原mRNA和蛋白表達,顯著下調TGF-β/Smad信號通路;臨床實踐表明,生肌玉紅膏可促進創面愈合,廣泛應用于糖尿病性潰瘍以及燒燙傷,效果顯著;體內實驗表明,生肌玉紅膏可抑制瘢痕增生,減少膠原沉積,減輕兔耳增生性瘢痕。同樣,血竭素B臨床可應用于燒燙傷,促進創面愈合;同時,血竭素B可下調TGF-β1/Smad信號通路,減輕兔耳增生性瘢痕。王文淇等[29]將斷體地龍提取液作用于小鼠創面,在創面修復后期,TGF-β下調,減少膠原沉積與瘢痕形成。這些數據表明,中藥或中藥提取物在促進創面愈合的同時,又可通過TGF-β/Smad信號通路發揮潛在的抑制瘢痕性增生的療效。

趙炳南使用“治翻車”療法治療慢性皮膚潰瘍瘡周異常纖維化,瘡面“缸口”板硬,利用黑布藥膏的活血化瘀、軟堅散結作用,緩慢軟化創面痂皮,盡可能減小其對正常組織的損害[30]。外用黑布藥膏可打破慢性創面的愈合停滯狀態,清除異常纖維化的肉芽組織,促進正常肉芽組織的生長,重新啟動創面的愈合機制。黑布藥膏中老黑醋的軟堅解毒、蜈蚣的破瘀攻毒以及五倍子的收斂解毒起關鍵作用,全方共奏破瘀軟堅、聚毒催膿之功,以消為主,消中帶托,破中有立[31]。另有研究表明,黑布藥膏可顯著降低局部組織中TGF-β1的表達,從而起到抑制瘢痕增生和攣縮發生的作用。此外,黑布藥膏中蜈蚣和五倍子可顯著抑制瘢痕疙瘩膠原蛋白的合成與hHSF的增殖,減少其DNA與膠原的合成。因此,黑布藥膏可抑制TGF-β表達和成纖維細胞活性,從而發揮抗皮膚纖維化的作用。因此,TGF-β/Smad信號通路是調控創面愈合與抗EMT過度的關鍵機制,從該通路出發,進行中醫藥在EMT過度所致的慢性創面的療效及藥效基礎研究具有廣闊的研究前景。

三、展 望

EMT經過了近40年的發展,但皮膚EMT的相關文章比例不足3%,對創面修復的研究也是針對如何促進EMT,而對抑制或逆轉皮膚EMT的研究仍比較欠缺。中醫藥一方面可加速創面愈合,一方面可通過抑制EMT與抗纖維化作用提高創面修復能力,從而有助于慢性難愈合創面“缸口”愈合。因此,抑制TGF-β/Smad和RAS/MAPK造成的EMT過程和纖維化可能成為促進創面愈合新的治療靶點,將為研究中醫藥治療慢性難愈合創面“缸口”的作用基礎和理論內涵提供新的思路和方向。