miR-891a-5p通過CPEB1調控結腸癌細胞生物過程的機制研究

張新燕，趙國棟

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一。研究顯示近年來結腸癌的發病率上升，發病年齡降低，對人類生命和健康構成嚴重威脅［1-2］。結腸癌在發病早期無特定癥狀，不易被發現。大多數患者在確診時已至晚期，預后較差。轉移性結腸癌患者的5年生存率遠低于非轉移性結腸癌患者［3-4］。尋找早期治療結腸癌的潛在靶點具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一種內源性保守的18～25個核苷酸組成的單鏈RNA分子，其可抑制mRNA的轉錄或蛋白翻譯過程，調控蛋白的表達，參與人類多種癌癥的發生發展過程［5-6］。miR-891a-5p 是新近發現的腫瘤相關miRNA，在黑色素瘤［7］中具有抑癌作用，在前列腺癌［8］中發揮促癌作用。細胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白（cytoplasmic polyadenylation element binding protein，CPEB）的抑癌功能已被證實［9］，但其與miR-891a-5p 間是否存在相互作用尚不明確。本研究擬通過觀察miR-891a-5p 在結腸癌組織、細胞中的表達及其對結腸癌細胞存活、凋亡、遷移和侵襲的影響，揭示其作用機制與CPEB1 之間的關系，以期為結腸癌治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 標本來源 結腸癌組織及癌旁組織來自海口市人民醫院2019年2月—2021年9月經結腸鏡檢查聯合病理學活檢診斷為結腸癌并接受手術切除的患者。排除標準：合并其他腫瘤者；預計存活時間小于3個月者；1個月內進行過外科手術者；可測量病灶不足2個者。共納入79例，年齡38～67歲，平均（54±3）歲，男40例，女39例。所有患者及家屬均簽署知情同意書，本研究經本醫院醫學倫理委員會批準［院科倫審：（2019）倫審第（9號）］。

1.2 主要試劑及儀器 人正常結腸上皮細胞NCM460、人結腸癌細胞LOVO、SW480、HCT116均購自美國菌種保藏中心；DMEM 培養液購自美國Gibco 公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；LipofectamineTM3000 轉染試劑盒購自美國Promega 公司；TRIzol 液購自美國賽默飛世爾科技公司；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒（Mir-X miRNA qRT-PCR）購自日本Takara公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）購自日本同仁化學研究所；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單抗、兔抗人細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）多抗購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人活化的胱天蛋白酶-3（C-caspase-3）單抗、兔抗人胱天蛋白酶-3 酶原（Pro-caspase-3）單抗購美國Bio Vision；兔抗人CPEB1多抗、兔抗人N-鈣黏蛋白（N-cadherin）多抗、兔抗人上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）多抗和兔抗人波形蛋白（Vimentin）多抗均購自美國Proteintech 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自美國賽默飛世爾科技公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Biotium 公司；miR-con、miR-891a-5p、anti-miR-con、anti-miR-891a-5p、si-con、si-CPEB1序列及引物的設計、合成均委托上海吉瑪基因股份有限公司完成。倒置顯微鏡購自日本Nikon 公司；凝膠成像系統、電泳儀、轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司；流式細胞儀購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 NCM460、LOVO、SW480、HCT116 細胞使用DMEM 培養液（含10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素混合液）于37 ℃、5%CO2的飽和濕度恒溫細胞培養箱中培養，每隔2 d更換1次新鮮培養液。

1.2.2 qPCR 檢測miR-891a-5p 表達 TRIzol 液提取組織和細胞總RNA，并將其反轉錄為cDNA后進行PCR反應。20 μL反應體系，hsa-miR-891a-5p 引物上游5'-GTGCAACGAACCTGAGC-3'，下游5'-GACCTGAACCTGAACCTGAA-3'，產物大小22 bp；U6 引物上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，產物大小13 bp。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火38 s，72 ℃延伸15 s，40 個循環。以U6 為內參，2-ΔΔCt法計算目的基因miR-891a-5p的相對表達水平。

1.2.3 分組與處理 依據1.2.2 篩選miR-891a-5p 表達水平最高的細胞LOVO 用于后續實驗。將LOVO 細胞分為A 組（不做任何處理）、B 組（轉染anti-miR-con）、C 組（轉染antimiR-891a-5p）、D 組（共轉染anti-miR-891a-5p 和si-con）、E組（共轉染anti-miR-891a-5p 和si-CPEB1）、F 組（轉染miRcon）、G組（轉染miR-891a-5p），用Lipofectamine 3000脂質體轉染12 h后更換新培養液繼續培養48 h。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖率 收集細胞，用培養液調至0．5×105個/mL，取200 μL置于96孔板，37 ℃培養10 h，取出細胞。每孔加入10 μL 的CCK-8 反應液，震蕩混勻，避光孵育20 min。在490 nm 波長下檢測細胞的光密度（OD490）。細胞增殖率=實驗組OD490/對照組OD490×100%。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡率 收集細胞，用預冷的PBS洗滌5次，再用500 μL結合緩沖液懸浮細胞。加入5 μL Annexin V/FITC，震蕩混勻，避光孵育15 min，再加入5 μL PI，振蕩混勻，孵育15 min。流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.6 蛋白免疫印跡實驗檢測細胞蛋白表達 收集細胞，冰上RIPA裂解30 min，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，沸水浴變性，取上清液上樣。SDS-PAGE 蛋白電泳，恒壓45 V電泳至條帶距離下緣1 cm，120 V 電泳至分離膠下緣結束電泳。用轉膜儀將凝膠上的蛋白轉移至NC 膜，整個轉膜過程需維持在0 ℃。轉膜結束后，用2．5%脫脂奶粉的封閉液將膜37 ℃封閉處理2 h。CPEB1（1∶1 500）、Cyclin D1（1∶1 000）、Pro-caspase-3（1∶2 500）、C-caspase-3（1∶2 000）、N-cadherin（1∶1 000）；E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日充分洗膜，山羊抗兔二抗（1∶500），37 ℃孵育2 h。充分洗膜，用ECL 發光液顯影曝光。Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH 為內參，目的蛋白與內參的比值表示蛋白的相對表達水平。

1.2.7 Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲 將待檢測的細胞用無血清的DMEM 培養液饑餓培養24 h。用無血清培養基調至5×106個/mL，取200 μL 均勻涂抹在Transwell 小室的上室。下室中加入500 mL 含10%血清的培養基，置于37 ℃培養箱中繼續培養至48 h。拭去上層未發生穿膜的細胞，將穿膜的細胞用結晶紫染色，顯微鏡下觀察細胞，5點法計數，取平均值。細胞侵襲能力的檢測使用帶有基質膠的Transwell小室檢測，具體操作步驟同上。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗檢測細胞的熒光活性 通過靶基因在線預測網站miRDB（http://mirdb．org/）預測miR-891a-5p 與CPEB1 靶向關系。根據預測到的CPEB1 結合位點化學合成含有CPEB1 3'-UTR 結合位點的序列（WTCPEB1）和不含CPEB1 3'-UTR 結合位點的序列（MUTCPEB1），并將其插入熒光載體pEGFPN1，構建熒光報告基因載體pEGFPN1-WT-CPEB1、pEGFPN1-MUT-CPEB1。將上述熒光報告基因載體與miR-con、miR-891a-5p、anti-miRcon、anti-miR-891a-5p 共轉染至細胞，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞的熒光活性。以海腎熒光活性為內參，螢火蟲熒光活性與海腎熒光活性之比表示細胞的熒光強度。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22．0軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示。多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。2 組數據比較用獨立樣本t檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-891a-5p在結腸癌組織和細胞中的表達情況 與癌旁組織相比，結腸癌組織miR-891a-5p 表達升高（4．46±1．11vs．1．08±0．14，n=79，t=26．852，P＜0．01）。LOVO、SW480、HCT116組細胞miR-891a-5p分別為6．42±0．51、5．66±0．66 和4．82±0．85，均顯著高于NCM460 細胞（1．06±0．12），其中LOVO 最高（n=9，F=54．091，P＜0．05）。

2.2 各組細胞增殖和凋亡情況比較 與B 組相比，C 組miR-891a-5p、CyclinD1 蛋白表達和增殖率降低，C-caspase-3蛋白表達和凋亡率升高（P＜0．05）；與D 組相比，E 組miR-891a-5p、Cyclin D1 蛋白表達和增殖率升高，C-caspase-3蛋白表達和凋亡率降低（P＜0．05）；各組Pro-caspase-3 蛋白表達差異無統計學意義。見圖1、2，表1。

Fig．1 Changes of apoptosis levels in each group圖1 各組細胞凋亡水平變化

Fig．2 Western blot results of Cyclin D1,Pro-caspase-3 and C-caspase-3 in each group圖2 各組細胞Cyclin D1、Pro-caspase-3、C-caspase-3蛋白印跡

2.3 各組細胞遷移、侵襲情況比較 與B組相比，C組N-cadherin、Vimentin 蛋白表達水平下降，細胞遷移、侵襲數量均降低，E-cadherin蛋白表達升高（P＜0．05）。與D 組相比，E 組N-cadherin、Vimentin 的蛋白表達水平升高，細胞遷移、侵襲數量均升高，Ecadherin蛋白表達降低（P＜0．05）。見表2，圖3、4。

2.4 miR-891a-5p 靶向調控CPEB1 miR-891a-5p與CPEB1的3'-UTR存在連續的6個互補結合位點，見圖5。與F 組相比，G 組WT-CPEB1 熒光活性和CPEB1 蛋白表達降低（P＜0．05）；與B 組相比，C 組WT-CPEB1 熒光活性和CPEB1 蛋白表達升高（P＜0．05），見表3、圖6。

Tab.1 Comparison of miR-891a-5p,Cyclin D1,Procaspase-3 and C-caspase-3 protein expression levels and proliferation and apoptosis rates between the five groups表1 各組miR-891a-5p、Cyclin D1、Pro-caspase-3、Ccaspase-3蛋白表達水平及增殖、凋亡率比較（n=9，±s）

Tab.1 Comparison of miR-891a-5p,Cyclin D1,Procaspase-3 and C-caspase-3 protein expression levels and proliferation and apoptosis rates between the five groups表1 各組miR-891a-5p、Cyclin D1、Pro-caspase-3、Ccaspase-3蛋白表達水平及增殖、凋亡率比較（n=9，±s）

＊P＜0．05；a與B組比較，b與D組比較，P＜0．05。

組別A組B組C組D組E組F miR-891a-5p 0．99±0．18 1．07±0．09 0．33±0．07a 0．35±0．06 0．77±0．09b 95．611＊CyclinD1 0．69±0．08 0．65±0．07 0．34±0．05a 0．29±0．03 0．54±0．06b 79．844＊Pro-caspase-3 0．28±0．04 0．25±0．04 0．27±0．05 0．24±0．03 0．26±0．05 1．236組別A組B組C組D組E組F C-caspase-3 0．15±0．04 0．17±0．03 0．48±0．05a 0．53±0．04 0．33±0．05b 148．945＊增殖率（%）100．89±10．68 98．74±9．25 71．64±8．17a 101．49±11．64 148．67±12．47b 62．285＊凋亡率（%）4．16±0．84 5．16±1．07 17．51±2．48a 15．39±1．88 8．43±1．12b 127．864＊

Tab.2 Comparison of N-cadherin,E-cadherin and Vimentin protein expression levels and migration and invasion numbers between the five groups表2 各組N-cadherin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達和遷移、侵襲細胞數比較（n=9，±s）

Tab.2 Comparison of N-cadherin,E-cadherin and Vimentin protein expression levels and migration and invasion numbers between the five groups表2 各組N-cadherin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達和遷移、侵襲細胞數比較（n=9，±s）

＊P＜0．05；a與B組比較，b與D組比較，P＜0．05。

組別A組B組C組D組E組F N-cadherin 0．75±0．08 0．78±0．06 0．43±0．05a 0．38±0．03 0．48±0．06b 92．726＊Vimentin 0．63±0．06 0．61±0．05 0．22±0．03a 0．27±0．05 0．63±0．07b 135．375＊E-cadherin 0．29±0．03 0．24±0．04 0．58±0．08a 0．44±0．05 0．19±0．03b 93．549＊遷移數（個/視野）147．94±11．84 145．46±12．85 61．48±5．58a 64．67±9．59 117．95±12．92b 134．882＊侵襲數（個/視野）84．38±8．79 84．38±8．79 47．76±4．64a 41．79±5．53 66．58±6．94b 70．183＊

3 討論

大量研究已證明，miRNA 參與多種癌癥的發病機制，部分miRNA表現出與癌基因或抑癌基因相似的功能。miR-891a-5p是近兩年新發現的癌癥相關miRNA，其在不同癌癥中的功能各不相同［10-12］。Wan 等［13］發現，miR-891a-5p 在非小細胞肺癌（NSCLC）患者血清和細胞中表達明顯升高，且miR-891a-5p高表達與患者腫瘤的轉移、臨床分期有關，過表達miR-891a-5p 還可促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，驗證了miR-891a-5p 在NSCLC 中的致癌功能。Jia等［14］基于TCGA數據庫進行Cox回歸分析發現，hsa-miR-891a-5p 在結腸癌組織中高表達與早期原發性腫瘤的發生相關，證實了其在結腸癌患者臨床中的診斷價值。本研究通過qPCR 實驗發現，miR-891a-5p在結腸癌組織和細胞中的表達均顯著升高，且抑制miR-891a-5p 能明顯降低結腸癌細胞的存活、遷移、侵襲能力，促進癌細胞的凋亡，下調增殖促進蛋白Cyclin D1、遷移侵襲促進蛋白Ncadherin 和Vimentin 表達，上調促凋亡蛋白Ccaspase-3、遷移侵襲抑制蛋白E-cadherin表達，表明miR-891a-5p具有促進結腸癌細胞表型進一步惡化的作用，提示miR-891a-5p 抑制劑在結腸癌中的潛在治療價值。進一步研究發現，miR-891a-5p 可靶向負調控CPEB1 的表達，這可能與miR-891a-5p 在結腸癌細胞中的作用具有一定關系。

Fig．3 Migration and invasion of each group of cells(crystal violet staining,×200)圖3 各組細胞遷移、侵襲情況（結晶紫染色，×200）

CPEBs 作為RNA 結合蛋白，通過轉錄后調控惡性轉化相關基因的表達［15-17］。Shao等［18-19］研究結果顯示，CPEB1在癌組織中發生高度甲基化，表現為基因的沉默，該基因可抑制大腸癌的腫瘤生長、侵襲、轉移，呈現出抑癌作用。Fang 等［20］研究發現，結腸癌組織中CPEB3表達降低，且與結腸癌患者的預后不良密切相關；敲減CPEB3 可促進結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，其機制為CPEB3 作為RNA 結合蛋白與酪氨酸蛋白激酶1（JAK1）mRNA 的3'-UTR 結合，誘導JAK-轉錄的信號轉導活化蛋白質（STAT）信號傳導，從而促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，表明CPEB3 可通過對JAK/STAT 信號通路的轉錄后調節抑制結腸癌的惡性發展。然而，CPEB1 在結腸癌中的上游調控因子尚未進行深入研究。本研究發現，CPEB1作為miR-891a-5p下游的靶基因，可能參與了miR-891a-5p在結腸癌中的功能調控。敲減CPEB1 能夠逆轉抑制miR-891a-5p 對結腸癌細胞表型的惡化的控制，促進Cyclin D1、N-cadherin和Vimentin 表達，抑制C-caspase-3、E-cadherin 表達，這驗證了miR-891a-5p 與CPEB1 之間的靶向關系。不足的是，這些實驗結果未在動物體內得到驗證，但是該結果可為下一步的動物實驗奠定基礎。

Fig．4 Western blot results of N-cadherin,E-cadherin and Vimentin in each group圖4 各組細胞N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的蛋白印跡結果

Fig．5 Nucleotide sequences complementary to miR-891a-5p in the 3'-UTR of CPEB1圖5 CPEB1的3'-UTR中與miR-891a-5p互補的核苷酸序列

Tab.3 Comparison of fluorescence activity of WTCPEB1 and MUT-CPEB1 and CPEB1 protein expression levels between the four groups表3 各組WT-CPEB1、MUT-CPEB1熒光活性和CPEB1蛋白表達水平比較（n=9，±s）

Tab.3 Comparison of fluorescence activity of WTCPEB1 and MUT-CPEB1 and CPEB1 protein expression levels between the four groups表3 各組WT-CPEB1、MUT-CPEB1熒光活性和CPEB1蛋白表達水平比較（n=9，±s）

＊P＜0．05。

組別F組G組t B組C組t WT-CPEB1 1．01±0．07 0．62±0．07 11．819＊0．95±0．09 1．82±0．11 18．364＊MUT-CPEB1 1．08±0．12 1．12±0．09 0．800 1．15±0．14 1．09±0．11 1．011 CPEB1 0．53±0．06 0．27±0．03 11．628＊0．59±0．06 0．85±0．08 7．800＊

Fig．6 Western blot results of CPEB1 in each group圖6 各組細胞CPEB1蛋白印跡結果

綜上所述，miR-891a-5p在結腸癌中高表達，可促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制凋亡，產生這種作用的潛在機制與靶向抑制CPEB1 密切相關，本研究為結腸癌的靶向治療提供新靶點。