ANA-12靶向抑制BDNF/TrkB信號緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)化療大鼠的痛覺行為

趙佳佳，萬文軍，楊荷雨，謝敏，劉玲△

奧沙利鉑（Oxaliplatin，OXA）是第3 代鉑類衍生物化療藥物，臨床上用于實體轉(zhuǎn)移瘤的治療，患者在化療后會發(fā)生急性神經(jīng)毒性，表現(xiàn)為四肢末梢遠(yuǎn)端感覺異常和疼痛等，遇冷刺激時癥狀明顯加重［1］。目前對于化療導(dǎo)致的神經(jīng)疼痛潛在機(jī)制不明確，且缺乏相應(yīng)的治療藥物。因此，研究化療痛的發(fā)生機(jī)制對相關(guān)藥物的開發(fā)具有必要性。神經(jīng)炎癥與多種病理性疼痛有關(guān)，包括炎性痛、神經(jīng)痛、癌痛及藥物治療引起的疼痛等［2］。組織損傷會導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放，直接刺激或誘導(dǎo)中樞敏化，最終導(dǎo)致慢性疼痛的發(fā)生［3］。神經(jīng)炎癥的特點包括膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生增加。脊髓膠質(zhì)細(xì)胞是促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-1β的主要來源［4］。在關(guān)節(jié)炎性疼痛患者中，中和TNF-α 可阻斷疼痛引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)傷害性活動［5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在炎性痛模型大鼠中，脊髓炎癥信號激活且促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加［6］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）可作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)參與痛覺調(diào)控［7］。BDNF/酪氨酸激酶受體B（TrkB）信號參與傷害性信號傳遞是痛覺維持的基礎(chǔ)，抑制TrkB可顯著改善動物痛覺行為［8］。為研究BDNF/TrkB信號在化療痛中的作用，本實驗使用TrkB 蛋白阻斷劑ANA-12 處理化療痛大鼠，檢測大鼠痛覺行為學(xué)、脊髓神經(jīng)炎癥及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)變化，旨在明確抑制BDNF/TrkB 信號對化療痛的緩解作用，并闡明其病理機(jī)制，為病理性疼痛的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 18 只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自湖北省實驗動物中心，6～8 周齡，體質(zhì)量200～250 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2020-0018。大鼠飼養(yǎng)在室溫為（22±2）℃的環(huán)境中，以12 h/12 h 晝夜節(jié)律變換并提供充足的食物和水。大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法均分為3 組：對照組、OXA 組及OXA+ANA-12 組。本研究所有動物實驗均經(jīng)湖北科技學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號2020-01-900。

1.2 主要試劑 蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液、十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠快速配制試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；OXA和ANA-12購于Selleck。IL-1β 兔多抗（A1112）、TNF-α 兔多抗（A0277）、Iba1 兔多抗（A1527）、BDNF 兔單抗（A4873）、TrkB 兔單抗（A19832）和phospho-TrkB-Y705 兔多抗（AP0423）購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；NF-κB p65兔多抗（AF5006）購于Affinity Biosciences。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L，AS014）和免疫熒光二抗異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L，AS011）購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 模型建立及藥物處理 OXA溶于5%葡萄糖溶液，OXA組和OXA+ANA-12 組每只大鼠腹腔注射OXA 4 mg/kg，連續(xù)5 d，建立OXA 化療痛大鼠模型。對照組大鼠注射相同體積的5%葡萄糖溶液。化療痛模型建立后進(jìn)行鞘內(nèi)給藥處理。具體方法如下：固定大鼠頭部和背部，露出髂嵴以下腰部區(qū)域進(jìn)行剃毛和皮膚消毒，輕輕按壓確定注射部位，用無菌微量注射器垂直插入大鼠脊髓腰膨大（L5～6）處，當(dāng)針碰到椎骨時，將進(jìn)針角度調(diào)整到30°，并將針插入椎間隙。進(jìn)針感覺到明顯的突破感，且大鼠出現(xiàn)突然的甩尾現(xiàn)象或后腿出現(xiàn)反射性彈跳，表明成功插入椎間隙，緩慢注入藥物，藥物注射完成后滯留1 min取出注射器［9］。OXA+ANA-12組大鼠鞘內(nèi)注射ANA-12（20 g/L），對照組和OXA 組大鼠鞘內(nèi)注射等體積DMSO+生理鹽水（體積比1∶1）。

1.4 大鼠行為學(xué)檢測

1.4.1 自發(fā)性縮足反射次數(shù) 將不同組別大鼠置于30 cm×30 cm×30 cm 的透明有機(jī)玻璃盒內(nèi)適應(yīng)30 min，觀察并記錄每5 min內(nèi)大鼠自發(fā)性縮足（或舔爪）反射次數(shù)來表征大鼠自發(fā)痛，每只記錄3次，取平均值。

1.4.2 50%縮足閾值（PWT）檢測 各組大鼠給藥處理后0、2、4 和6 h，根據(jù)up-down 法檢測50%PWT。方法如下：將動物置于行為測試籠內(nèi)，待適應(yīng)30 min后，用Von Frey纖維（觸覺刺激力0．4～26 g）垂直剌激大鼠左側(cè)后肢足底正中，持續(xù)時間≤5 s，出現(xiàn)舔足或者抬足等行為視為陽性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。記錄6次數(shù)據(jù)后結(jié)束檢測。根據(jù)公式50%PWT（g）=（10［Xf+Kδ］）/10 000計算各組大鼠的縮足閾值（Xf為本次行為學(xué)測試中使用的最后一個Von Frey 纖維的階數(shù)，K 為痛覺閾校正系數(shù)，δ為相鄰纖維刺激之間的差異）［10］。

1.5 免疫印跡法檢測脊髓組織蛋白質(zhì)表達(dá) 行為學(xué)記錄結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取3只大鼠，過量麻醉處死后，分離脊髓組織，置于預(yù)冷的PBS 中。取腰段脊髓置于含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中，在冰上進(jìn)行組織勻漿。收集組織勻漿液于離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液，加入1/3體積的4×上樣緩沖液，沸水中加熱10 min 變性。使用BCA蛋白分析試劑盒檢測樣品的蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)樣品，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉l h，一抗4 ℃孵育過夜。所用一抗如下：TNF-α（1∶1 000）、

IL-1β（1∶1 000）、Iba1（1∶1 000）、BDNF（1∶1 000）、phospho-TrkB-Y705（1∶500）、TrkB（1∶1 000）、NF-κB（1∶1 000）。一抗孵育后洗膜3次，并用二抗室溫孵育1 h，然后用LAS500凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6 組織形態(tài)學(xué)檢測 采用HE 染色法對脊髓組織切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。每組剩余的3只大鼠在深度麻醉后，經(jīng)心臟快速灌流肝素生理鹽水，然后4%多聚甲醛固定。固定成功后取完整腰段脊髓進(jìn)行脫水和石蠟包埋，切成厚度為4 μm的組織切片。選擇形態(tài)完好的組織進(jìn)行脫蠟和HE 染色，蘇木素染色20 min，分化后返藍(lán)，至核顯深紫色，胞漿呈淺藍(lán)色，用伊紅染至胞漿呈紅色，用不同濃度的乙醇透明，中性樹膠封片，并在顯微鏡下觀察，Image J 軟件分析。脊髓炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［11］：正常記0分，腦膜和血管周圍的淋巴細(xì)胞浸潤記1分，一個視野中有1～10個淋巴細(xì)胞記2分，有11～100個淋巴細(xì)胞記3分，有100個以上的淋巴細(xì)胞記4分。

1.7 免疫熒光染色 選取形態(tài)完整的脊髓組織脫蠟處理后進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫孵育10 min，PBS洗滌3次，免疫染色封閉液封閉1 h，加入IL-1β（1∶100）、Iba1（1∶100）、BDNF（1∶100）一抗，4 ℃條件下孵育過夜。熒光二抗室溫下孵育1 h，用PBS 洗3 次，滴加抗熒光淬滅試劑封片并在熒光顯微鏡下觀察，Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph pad prism 8．0．2 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示。2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA-12對化療痛大鼠痛覺行為的影響 行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，OXA 組大鼠機(jī)械縮足閾值顯著降低，自發(fā)縮足次數(shù)顯著增加；與OXA組相比，OXA+ANA-12組大鼠機(jī)械痛閾值顯著增加，自發(fā)縮足次數(shù)顯著降低（P＜0．01），見表1。

Tab.1 Comparison of behavioral test results in rats between the three groups表1 3組大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of behavioral test results in rats between the three groups表1 3組大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果比較（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與對照組比較，b與OXA組比較，P＜0．01。

組別對照組OXA組OXA+ANA-12組F PWT（g）15．10±0．26 6．00±0．26a 10．20±0．46ab 533．400＊＊縮足次數(shù)（次）5．33±0．58 25．00±1．00a 6．67±1．15b 407．625＊＊

2.2 ANA-12 對大鼠脊髓炎癥的影響 脊髓HE 染色結(jié)果顯示，與對照組相比，OXA 組大鼠脊髓背角炎性細(xì)胞浸潤明顯增加，炎癥評分升高；與OXA 組相比，OXA＋ANA-12 組炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，炎癥評分下降（P＜0．01），見表2、圖1。免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，OXA 組大鼠脊髓背角圖中綠染的IL-1β 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；與OXA 組相比，OXA+ANA-12組圖中綠染的IL-1β熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0．01），見表2、圖2。免疫印跡結(jié)果顯示，OXA 組大鼠脊髓組織中TNF-α 和IL-1β 表達(dá)量均顯著高于對照組；而與OXA 組相比，OXA+ANA-12組TNF-α和IL-1β表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0．01），見圖3、表3。

Tab.2 Comparison of inflammatory score and fluorescence intensity of IL-1β in spinal cord of rats between the three groups表2 各組大鼠脊髓炎癥評分和IL-1β熒光強(qiáng)度比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of inflammatory score and fluorescence intensity of IL-1β in spinal cord of rats between the three groups表2 各組大鼠脊髓炎癥評分和IL-1β熒光強(qiáng)度比較（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與對照組比較，b與OXA組比較，P＜0．05。

組別對照組OXA組OXA+ANA-12組F炎癥評分（分）2．28±0．10 2．94±0．07a 2．35±0．06b 72．300＊＊IL-1β 1．00±0．00 1．64±0．11a 0．77±0．07ab 109．509＊＊

2.3 ANA-12處理對小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)的影響 免疫熒光檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1 顯示，與對照組相比，OXA 組大鼠脊髓背角中綠染的Iba1熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0．05）；與OXA 組相比，OXA+ANA-12組大鼠脊髓背角中綠染的Iba1 熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0．01），見圖4、表4。免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，OXA 組大鼠脊髓組織中Iba1蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0．05）；而與OXA 組相比，OXA+ANA-12 組脊髓組織中Iba1 蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0．01），見圖5、表4。

Fig．1 Inflammatory cell infiltration of spinal dorsal horn in each group(HE staining,scale bar=20 μm)圖1 各組大鼠脊髓背角炎性細(xì)胞浸潤情況（HE染色，標(biāo)尺=20 μm）

Fig．2 Expression of IL-1β in spinal dorsal horn of rats in each group(Immunofluorescent staining,scale bar=20 μm)圖2 各組大鼠脊髓背角IL-1β的表達(dá)（免疫熒光染色，標(biāo)尺=20 μm）

Fig．3 Expression levels of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α in spinal cord of rats in each group detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測各組大鼠脊髓組織促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α表達(dá)水平

Tab.3 Comparison of expression levels of IL-1β and TNF-α in spinal cord of rats between the three groups表3 各組大鼠脊髓組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of IL-1β and TNF-α in spinal cord of rats between the three groups表3 各組大鼠脊髓組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與對照組比較，b與OXA組比較，P＜0．01。

組別對照組OXA組OXA+ANA-12組F IL-1β 1．00±0．00 2．37±0．06a 1．57±0．09ab 355．028＊＊TNF-α 1．00±0．00 2．04±0．14a 1．58±0．16ab 54．769＊＊

Fig．4 Expressions of Iba1 in spinal dorsal horn of rats in each group(Immunofluorescent staining,scale bar=20 μm)圖4 各組大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1的表達(dá)（免疫熒光染色，標(biāo)尺=20 μm）

Fig．5 Expression levels of microglial marker Iba1 in spinal cord of rats in each group detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測各組大鼠脊髓組織小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba1表達(dá)水平

Tab.4 Comparison of expression levels of Iba1 in spinal cord of rats between the three groups表4 各組大鼠脊髓組織中Iba1表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of expression levels of Iba1 in spinal cord of rats between the three groups表4 各組大鼠脊髓組織中Iba1表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與對照組比較，b與OXA組比較，P＜0．05。

組別對照組OXA組OXA+ANA-12組F熒光強(qiáng)度1．00±0．00 1．71±0．04a 1．11±0．09b 144．794＊＊蛋白表達(dá)水平1．00±0．00 1．40±0．05a 0．88±0．06ab 99．441＊＊

2.4 ANA-12 處理對BDNF/TrkB 信號活性的影響 與對照組相比，OXA 組大鼠脊髓組織中綠染的BDNF 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；與OXA 組相比，OXA+ANA-12 組脊髓組織中綠染的BDNF 熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0．01），見圖6、表5。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，OXA大鼠脊髓組織中BDNF和磷酸化TrkB（Y705）表達(dá)水平上調(diào)（P＜0．05）；而與OXA 組相比，ANA-12 處理后BDNF 和磷酸化TrkB表達(dá)水平均顯著降低（P＜0．01），見圖7、表5。

2.5 ANA-12 處理對NF-κB 信號活性的影響 免疫印跡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組（1．00±0．00）相比，OXA 組脊髓組織中NF-κB 表達(dá)水平（1．52±0．02）增高（P＜0．01）；與OXA 組相比，OXA+ANA-12 組NFκB表達(dá)水平（0．91±0．03）降低（n=3，F(xiàn)=1 202．680，P＜0．01），見圖8。

Fig．6 Expression of BDNF in spinal dorsal horn of rats in each group(Immunofluorescent staining,scale bar=20 μm)圖6 各組大鼠脊髓背角BDNF的表達(dá)（免疫熒光染色，標(biāo)尺=20 μm）

Fig．7 Expression levels of BDNF,phosphorylated TrkB(Y705)and total TrkB in spinal cord of rats in each group detected by Western blot assay圖7 Western blot檢測各組大鼠脊髓組織中BDNF、磷酸化TrkB（Y705）和總的TrkB表達(dá)水平

Tab.5 Comparison of expression levels of BDNF,phosphorylated TrkB(Y705)and total TrkB in spinal cord between three groups of rats表5 各組大鼠脊髓組織中BDNF、磷酸化TrkB（Y705）和總的TrkB表達(dá)水平的作用比較（n=3，±s）

Tab.5 Comparison of expression levels of BDNF,phosphorylated TrkB(Y705)and total TrkB in spinal cord between three groups of rats表5 各組大鼠脊髓組織中BDNF、磷酸化TrkB（Y705）和總的TrkB表達(dá)水平的作用比較（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與對照組比較，b與OXA組比較，P＜0．05。

組別對照組OXA組OXA+ANA-12組F pTrkB/TrkB 1．00±0．00 1．70±0．03a 0．88±0．05ab 466．694＊＊熒光強(qiáng)度1．00±0．00 1．60±0．12a 0．70±0．02ab 122．231＊＊BDNF 1．00±0．00 1．42±0．04a 1．10±0．06ab 99．464＊＊

Fig．8 Expression levels of NF-κB in spinal cord of rats detected by Western blot assay圖8 Western blot檢測各組大鼠脊髓組織中NF-κB表達(dá)水平

3 討論

3.1 OXA 過量使用誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥 化療是治療癌癥的一種常用的有效手段之一。第3代鉑類抗癌藥物OXA 可直接結(jié)合并交聯(lián)于DNA 上，抑制細(xì)胞DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，臨床上用于治療各類惡性腫瘤［12］。然而，當(dāng)使用累積劑量達(dá)到300 mg/m2時會產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為神經(jīng)損傷及病理性疼痛［13］。過量OXA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷會造成外周傷害性信號上調(diào)，從而導(dǎo)致脊髓神經(jīng)突觸可塑性增強(qiáng)，進(jìn)而使神經(jīng)炎癥增加［14］。神經(jīng)炎癥表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞激活、促炎細(xì)胞因子水平增加、外周白細(xì)胞浸潤和神經(jīng)組織損傷，其中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子［15］。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬樣細(xì)胞，可快速響應(yīng)外界傷害性變化，在受到外界傷害后幾分鐘內(nèi)會發(fā)生快速的形態(tài)變化（如胞體增大和突起縮短），并分泌多種細(xì)胞因子（包括TNF-α 和IL-1β），參與疼痛的發(fā)生和維持［16］。據(jù)此，本研究中OXA 大鼠脊髓炎性因子表達(dá)上調(diào)的主要原因是外周傷害性信號誘導(dǎo)的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

3.2 抑制BDNF 信號緩解大鼠炎癥痛 BDNF 具有多種生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活、生長和分化并維持突觸可塑性以及在傷害性信號傳遞途徑中發(fā)揮調(diào)控作用［17］。多種痛覺模型證明，BDNF 在痛覺傳導(dǎo)區(qū)域過度表達(dá)。BDNF 是小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號分子。研究表明，外周損傷可誘發(fā)脊髓釋放BDNF，從而介導(dǎo)炎癥及疼痛［18］。用TrkB 抗體或者TrkB-Fc 阻斷BDNF-TrkB 信號可有效防止小膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)的機(jī)械性痛覺過敏；siRNA敲低BDNF可緩解小膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)的疼痛行為［19］。炎癥誘導(dǎo)的痛覺過敏研究顯示，促炎刺激可上調(diào)脊髓背角BDNF/TrkB 通路；而阻斷BDNF/TrkB 信號通路可降低炎性疼痛進(jìn)展［20］。NF-κB 是炎癥激活的主要因子之一，BDNF 與TrkB 受體結(jié)合后能夠誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)。BDNF通過激活激酶Ikkα和Ikkβ誘導(dǎo)NFκB表達(dá)，同時這些激酶可以磷酸化并降解NF-κB的抑制單位IκBα，從而導(dǎo)致NF-κB 釋放以及p50/p65二聚體的形成，p50/p65 二聚體與DNA 結(jié)合并誘導(dǎo)與神經(jīng)元增殖、存活和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)［21］。NF-κB介導(dǎo)的促炎信號通路通過促進(jìn)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)而參與炎癥反應(yīng)。在骨癌痛大鼠模型中，脊髓BDNF表達(dá)增強(qiáng)，阻斷其信號可減弱熱痛覺過敏和機(jī)械性痛覺超敏并抑制下游NF-κB通路［22］。在本研究中，OXA 大鼠脊髓BDNF/TrkB 信號活性上調(diào)并伴隨NF-κB 表達(dá)上調(diào)，ANA-12 可顯著減少上述蛋白的表達(dá)并緩解OXA 誘導(dǎo)的痛覺行為，表明抑制BDNF/TrkB 信號可通過降低OXA誘導(dǎo)的炎癥信號而緩解化療痛。

綜上所述，TrkB 受體拮抗劑ANA-12 對OXA 誘導(dǎo)的痛覺行為具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，主要是通過降低小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、抑制BDNF/TrkB 信號下游NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號，從而減少脊髓炎癥，發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。