網狀蛋白1C水平與三陰性乳腺癌新輔助化療療效的相關性研究

張曼麗，劉唯唯，王麗娟，李衛東

三陰性乳腺癌（TNBC）占乳腺癌的19%～38%，其復發率和病死率均較高［1-2］。TNBC對靶向治療和激素治療均不敏感，其主要治療方法為化療和手術［3］。新輔助化療是TNBC的主要治療方法之一，若新輔助化療后病理學完全緩解，則預示TNBC 患者預后良好［4］。腫瘤形態分類及傳統影像學技術對新輔助化療療效評估具有滯后性［5］。因此，臨床需要準確度高的指標預判新輔助化療療效。網狀蛋白1C（RTN-1C）是網狀蛋白家族的一員，其主要存在于內質網膜，可調節內質網結構和功能［6］。有研究報道RTN-1C 與細胞自噬關系密切，干擾RTN-1C表達可抑制細胞自噬［7］。自噬在腫瘤發生發展過程中扮演著雙重角色，適度自噬可幫助腫瘤細胞在放化療后在不利的條件下存活，而過度自噬可促進腫瘤細胞凋亡，因此，腫瘤細胞的自噬程度與新輔助化療療效有關［8-10］。然而，RTN-1C 表達和TNBC 新輔助化療療效是否有關目前研究較少。因此，本研究分析RTN-1C和TNBC新輔助化療療效的關系，以期為評價新輔助化療療效提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年7月—2020年12月在滄州市人民醫院接受治療的TNBC 女性患者為研究對象。TNBC 診斷參照《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范》［11］。納入標準：（1）經病理活檢及免疫組化檢查確診為TNBC。（2）TNM 分期Ⅱ～Ⅲ期。（3）接受新輔助化療聯合手術治療方案。排除標準：（1）于新輔助化療前接受免疫治療。（2）臨床資料不完整。（3）既往有惡性腫瘤史。（4）存在遠處轉移。本研究最終納入154例TNBC患者，年齡29～66歲，平均（45．21±6．59）歲。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》，所有受試者知情同意并簽署知情同意書，經滄州市人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 臨床信息收集 收集所有受試者年齡、月經狀態、病理類型、TNM分期、組織學分級和Ki-67表達＞30%情況、腫瘤直徑。

1.3 新輔助化療方案 所有受試者均給予新輔助化療，方案如下：多西他賽（75 mg/m2，浙江海正藥業股份有限公司，國藥準字H20093092）、表柔比星（60 mg/m2，浙江海正藥業股份有限公司，國藥準字H20041211）聯合環磷酰胺（500 mg/m2，山西普德藥業股份有限公司，國藥準字H14023686），21 d 為1個療程，所有受試者術前均接受≥4個療程的新輔助化療。本研究將新輔助化療療程結束后乳腺原發病灶中未發現惡性腫瘤的組織學證據或僅存在原位癌成分定義為病理學完全緩解［11］。

1.4 蛋白質免疫印跡法檢測RTN-1C 表達水平 抽取所有受試者化療前（T0）、化療7 d（T1）、化療14 d（T2）和化療21 d（T3）空腹肘正中靜脈血10 mL，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。蛋白質免疫印跡法檢測單個核細胞中RTN-1C 表達水平：（1）用RIPA 裂解液裂解單個核細胞，獲取總蛋白。（2）BCA 法蛋白定量。（3）10%的SDS-PAGE 分離膠電泳，電壓120 V 至溴酚藍跑出膠面，恒流300 mA 轉膜120 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。（4）兔抗人RTN-1C單克隆抗體（武漢維克賽斯科技有限公司），稀釋比為1∶1 000，4 ℃孵育過夜。（5）山羊抗兔二抗（北京百奧萊博科技有限公司），稀釋比為1∶5 000，室溫下孵育2 h。（6）ELC發光液顯影，內參為β-actin，用Image J軟件讀取灰度值。

1.5 統計學方法 采用R（3．6．3 版）軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗；重復測量數據采用單因素重復測量方差分析。計數資料以例或例（%）表示，組間比較用χ2檢驗。采用受試者工作特征（ROC）曲線評價RTN-1C 判斷新輔助化療療效的效能。Logistic 回歸分析新輔助化療療效的風險因素。構建列線圖回歸模型預測新輔助化療后病理學完全緩解，一致性指數（C-index）、校準曲線（Cilibration）和決策曲線（DCA）評估模型效能。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 組RTN-1C 表達水平比較 154 例患者中絕經者55 例；浸潤性導管癌134 例，浸潤性小葉癌13例，髓樣癌7例；T1期11例，T2期106例，T3期37例；N0期42例，N1期70例，N2期42例；TNM分期：Ⅱ期100 例，Ⅲ期54 例；按照組織學分級，Ⅰ級27 例，Ⅱ級105 例，Ⅲ級22 例；Ki-67 表達＞30%122 例。根據新輔助化療療效將患者分為完全緩解組（47 例）和未完全緩解組（107 例）。T1和T3時點完全緩解組的RTN-1C均低于未完全緩解組（P＜0．05）；2組T0、T1、T2時點的RTN-1C相對表達水平隨時間進展均降低（P＜0．01）。見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of RTN-1C expression levels between the two groups表1 2組RTN-1C表達水平比較（±s）

Tab.1 Comparison of RTN-1C expression levels between the two groups表1 2組RTN-1C表達水平比較（±s）

＊＊P＜0．01；a與T0比較，b與T1比較，c與T2比較，P＜0．05。

組別完全緩解組未完全緩解組t n T0 T1 T2 T3 F 47 2．15±0．32 1．52±0．21a 1．06±0．17ab 0．88±0．09abc 320．408＊＊107 2．16±0．34 1．65±0．31a 1．02±0．20ab 0．97±0．08ab 510．894＊＊0．088 3．128＊＊1．028 6．797＊＊

Fig．1 Western blot assay of RTN-1C expression in the two groups圖1 2組RTN-1C表達的蛋白質免疫印跡圖

2.2 RTN-1C 評價新輔助化療療效的價值 T3-RTN-1C判斷新輔助化療后病理學完全緩解的ROC曲線下面積（AUC）高于T0-RTN-1C、T1-RTN-1C 和T2-RTN-1C（Z分別為4．652、3．098 和4．509，P＜0．01），最佳截斷點為0．91，見表2、圖2。

Tab.2 RTN-1C in judging the efficacy of neoadjuvant chemotherapy表2 RTN-1C判斷新輔助化療療效

2.3 完全緩解組和未完全緩解組的基線資料比較 完全緩解組和未完全緩解組的年齡、月經狀態、病理類型和腫瘤直徑差異均無統計學意義（P＞0．05）。完全緩解組Ki-67＞30%、T3-RTN-1C≤0．91、N0 期和組織學分級Ⅰ級占比均高于未完全緩解組（P＜0．05），見表3。

Fig．2 ROC curve of RTN-1C in judging pathological complete remission after neoadjuvant chemotherapy圖2 RTN-1C判斷新輔助化療后病理學完全緩解的ROC曲線

2.4 新輔助化療療效的風險因素分析 以病理學是否完全緩解為因變量（完全緩解=0，未完全緩解=1），Ki-67（≤30%=0，＞30%=1）、T3-RTN-1C（≤0．91=0，＞0．91=1）、N 分期（N0=0，N1＋N2=1）和組織學分級（Ⅰ＋Ⅱ=0，Ⅲ=1）為自變量，納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示T3-RTN-1C＞0．91、N1 期或N2期、組織學分級Ⅲ級是新輔助化療后病理學未完全緩解的獨立危險因素（P＜0．05），見表4。

2.5 新輔助化療后病理學完全緩解的列線圖模型構建及評價 用Logistic 回歸分析篩選的危險因素構建列線圖模型，由N分期、組織學分級和T3-RTN-1C 構建的列線圖模型A，見圖3A；由N 分期和組織學分級構建的列線圖模型B，見圖3B。經1 000次自助重抽樣，與實際情況比較，結果顯示模型A的擬合曲線和理想曲線重合度較高，均方誤差（MSE）為0．002，見圖3C；模型B 的擬合曲線和理想曲線重合度較差，MSE 為0．003，見圖3D。模型A、B 的Cindex 分別為0．866和0．772。DCA 顯示，當閾值概率大于0．40 時，模型A 判斷新輔助化療后病理學完全緩解的凈收益高于模型B，見圖3E。

Tab.3 Comparison of baseline data between the two groups表3 2組的基線資料比較［例（%）］

3 討論

Tab.4 Logistic regression analysis of risk factors of neoadjuvant chemotherapy表4 新輔助化療療效風險因素的Logistic回歸分析

TNBC對化療具有一定敏感性，但經過常規化療后預后仍較差。有研究顯示，新輔助化療可提高腫瘤手術完全切除率，延長生存時間，但新輔助化療后未得到病理性完全緩解的TNBC 患者的預后較差［12］。準確預測新輔助化療后病理性完全緩解不僅可用于手術切除程度評價，還可作為TNBC 患者預后標志物［13］。

化療、放療等抗癌療法可誘導癌細胞自噬，從而增加抗藥性［14］。目前已有研究表明癌細胞自噬與抗癌治療療效有關，準確了解癌細胞自噬程度或可預判抗癌治療療效［15-17］。細胞自噬是依靠溶酶體將細胞內受損的細胞器和大分子物質降解的過程，包括以下4個過程：雙層膜的杯狀分隔膜形成、自噬體形成、自噬體運輸其包裹物與溶酶體融合、自噬體被溶酶體降解［18］。RTN-1C在細胞自噬過程中發揮著重要作用，其可上調LC3和自噬體積累，從而促進自噬小體形成［19］。此外，RTN-1C 還可靶向內質網應激通路調節線粒體結構和功能，促進線粒體相關內質網膜形成，從而調節自噬［7］。腫瘤及腫瘤相關免疫等疾病狀態與外周血單個核細胞中部分基因或蛋白表達差異有關［20］，外周血單個核細胞中某基因或蛋白表達差異可能對腫瘤診斷及預后評估有潛在價值。

本研究結果顯示完全緩解組T1和T3時點RTN-1C 均低于未完全緩解組，2 組RTN-1C 相對表達水平隨時間進展均降低，提示外周血單個核細胞中RTN-1C 表達水平與新輔助化療療效有關，其表達水平或可評價新輔助化療療效。本研究構建RTN-1C 判斷新輔助化療療效的ROC 曲線結果顯示T3-RTN-1C判斷新輔助化療后病理學完全緩解的AUC高于T0-RTN-1C、T1-RTN-1C 和T2-RTN-1C，表明T3-RTN-1C判斷新輔助化療后病理學完全緩解的效能較高，可輔助評價新輔助化療療效。

本研究中Logistic 回歸分析結果顯示T3-RTN-1C＞0．91是新輔助化療后病理學未完全緩解的獨立危險因素，推測其原因是RTN-1C調節細胞自噬，新輔助化療21 d后RTN-1C表達水平降低時癌細胞自噬程度降低，癌細胞此時較難通過自噬途徑抑制化療藥物誘發的損傷。因此，新輔助化療后RTN-1C表達水平降低預示病理學完全緩解。劉杰娜等［5］研究結果顯示，乳腺癌患者Ki-67 高表達是新輔助化療后病理學完全緩解的預測因子。劉德樟等［13］研究結果表明，Ki-67表達水平與新輔助化療療效無關。本研究結果顯示Ki-67 表達與新輔助化療療效無關，推測該差異與乳腺癌類型、樣本量及地域等因素有關，關于Ki-67 表達水平與新輔助化療療效的關系還需大樣本、多中心研究進行證實。

Fig．3 Construction and evaluation of nomogram model圖3 列線圖模型構建及評價

為彌補單指標T3-RTN-1C 評價新輔助化療療效的不足，本研究構建了基于T3-RTN-1C、N分期和組織學分級的列線圖回歸模型。模型A判斷新輔助化療后病理學完全緩解的C-index 高于模型B，MSE低于模型B，表明模型A有更高的區分度和精準度。此外，當閾值概率大于0．40時，模型A判斷新輔助化療后病理學完全緩解的凈收益高于模型B。因此，本研究認為模型A對于新輔助化療后病理學完全緩解有較高的臨床應用價值，當然，還需要大樣本研究驗證模型A的價值。

綜上所述，TNBC患者新輔助化療后21 d外周血單個核細胞中RTN-1C表達水平高提示病理學未完全緩解風險增加。模型A判斷新輔助化療后病理學完全緩解有較高的區分度、精準度和臨床應用價值。本研究尚存在一定不足：一是本研究為單中研究，納入樣本量有限，且樣本選擇可能存在一定選擇偏倚，后續還需開展大樣本、多中心研究；二是本研究未評價RTN-1C 與TNBC 遠期預后的關系，后續將隨訪TNBC，以了解RTN-1C與TNBC遠期預后的關系；三是未開展基礎研究分析RTN-1C 參與TNBC 化療的病理生理機制；四是僅分析了T0、T1、T2和T3時點的RTN-1C 與新輔助化療后病理學完全緩解的關系，對于其他時點的RTN-1C與新輔助化療后病理學完全緩解的關系還未可知。