基因表達譜分析非酒精性脂肪性肝病中谷胱甘肽轉移酶的作用

沈婷婷， 朱哿瑞， 王 帆， 孫 鑫， 黃 愷， 彭 淵， 陶艷艷， 劉成海,

1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院·肝病研究所， 上海 201203； 2 上海市中醫臨床重點實驗室， 上海 201203

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是除外酒精和其他明確肝損傷因素所致的，以肝細胞彌漫性脂肪變為特征的臨床綜合征。其疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝細胞癌[1]。谷胱甘肽是細胞中合成最豐富的低分子量抗氧化劑，在保護細胞免受氧化損傷和外源親電子試劑的毒性，以及維持氧化還原穩態中發揮著關鍵作用[2]。谷胱甘肽轉移酶(GST)主要存在于肝臟內[3]，是一組與肝臟解毒功能有關的酶，參與細胞損傷、缺氧、中毒、衰老等過程[4]。據編碼基因的不同將GST分為三個亞家族[5]，其中線粒體GST在肥胖癥、糖尿病等能量和脂類代謝中起到非常重要的作用[6]。本研究通過高脂飲食建立小鼠NAFLD模型，采用RNA-Seq技術結合生物信息學分析探討GST在NAFLD中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性C57BL/6J小鼠，14只，SPF級，體質量23～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物使用許可號：SCXK(滬)2020-0009；實驗動物生產許可證號：SYXK(滬)2020-009。溫度21～25 ℃，濕度55%～65%，12 h明暗光照循環。

1.1.2 試劑 60 kcal%脂肪的高脂飼料(貨號:112252)，購于戴茨生物科技(無錫)有限公司。ALT試劑盒(批號：20130110)、AST試劑盒(批號：20130411)、TG、蘇木素-伊紅染液(貨號：D006-1-3)，均購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑(批號：F919KB3054)、總RNA提取試劑盒(批號：B518811)，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；反轉錄試劑盒(貨號：RR047)、擴增試劑盒(貨號：RR820)，購于日本Takara株式會社。

1.1.3 儀器 熒光倒置顯微鏡，日本Olympus株式會社(型號：Olympus IX70)；實時熒光定量PCR儀，美國Life Technonogy公司(型號：ABI Vii A7)；超微量分光光度計，美國Thermo Scientific公司(型號：NanoDrop 2000)；生物分析儀，美國Agilent Technologies公司(型號：Agilent 2100 Bioanalyzer)；高通量測序儀，美國Illumina公司(型號：Illumina HiSeq X Ten)。

1.2 分組與造模 小鼠適應性喂養1周后，隨機抽樣分為對照組(n=6)和模型組(n=8)。小鼠自由飲水，對照組小鼠喂養普通飼料、模型組喂養高脂飼料(熱量比：碳水化合物20%，脂肪60%，蛋白質20%)，連續7周。造模結束后，小鼠禁食16 h，3 %戊巴比妥鈉麻醉、固定，打開腹腔，下腔靜脈取血，4 ℃、3000 r/min離心15 min，血清置于-80 ℃冰箱保存，用于測定ALT、AST、TG。肝右葉切割1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小置于4%甲醛固定液中，用于HE染色。另取肝組織各100 mg存于TRIzol中，用于提取RNA。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 血清ALT、AST、TG測定 按試劑盒說明書測定小鼠血清中ALT、AST活性及TG水平。

1.3.2 肝臟病理情況 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察小鼠肝組織病理。小鼠肝組織經4%中性甲醛緩沖液固定，自動脫水機脫水、石蠟包埋、4 μm切片、HE染色、光學顯微鏡觀察并拍照。脂肪肝分級依據肝細胞脂肪變性占據所獲肝組織標本量范圍，分為F0～4：F0<5%肝細胞脂肪變；F1：5%～30%肝細胞脂肪變；F2：31%～50%肝細胞脂肪變；F3：51%～75%肝細胞脂肪變；F4：75%以上肝細胞脂肪變[1,7]。油紅染色方法：肝臟冰凍切片(8 μm厚度)用于脂質染色。切片用甲醛-鈣固定10 min，蒸餾水洗滌；油紅O染液染色15 min，60%異丙醇分色3～5 s，去多余染液，蒸餾水洗；Mayer蘇木精復染；自來水洗(藍化)1～3 min；蒸餾水洗；甘油明膠封片。

1.3.3 肝組織RNA提取 TRIzol提取肝組織總RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計評估RNA的純度和含量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer質檢合格后，使用Illumina HiSeq X Ten 測序儀進行測序，產生150 bp的雙端數據。建庫測序及數據分析部分由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

1.3.4 參考基因組比對 利用hisat2(2.2.1.0)軟件將Clean Reads與指定的參考基因組進行序列比對，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測序樣品特有的序列特征信息。

1.3.5 蛋白編碼基因表達水平分析 用已知的參考基因序列以及注釋文件作為數據庫，采取序列相似性比對的方法鑒定出各蛋白編碼基因在各樣本中的表達豐度。使用htseq-count(0.9.1)軟件獲取每個樣本中比對到蛋白編碼基因上的reads數，根據公式計算蛋白編碼基因的表達量FPKM(Fragment Per Kilo Bases per Million reads)值。

1.3.6 差異表達基因篩選 基于基因表達水平分析獲得的reads數進行差異表達基因篩選，利用DESeq(v1.18.0)軟件對各個樣本基因的reads數進行標準化處理(采用basemean值來估算表達量)，計算差異倍數，并采用負二項分布檢驗的方式對reads數進行差異顯著性檢驗，最終根據差異倍數及差異顯著性檢驗結果來篩選差異蛋白編碼基因，篩選差異的條件為P<0.05且差異倍數(fold change, FC)≥2[8]。

1.3.7 差異表達基因的GO和KEGG富集分析 得到差異基因后，對差異表達基因進行GO和KEGG富集分析。方法：將全部蛋白編碼基因作為背景列表，差異蛋白編碼基因列表作為從背景列表中篩選出來的候選列表，利用超幾何分布檢驗，計算P值，Benjamini & Hochberg多重檢驗糾正后，對于correctedP-value<0.05的GO條目定義為差異表達基因中顯著富集的GO條目。將差異表達基因應用KEGG數據庫預測其參與的信號通路。以correctedP-value<0.05為標準，篩選在差異表達基因中顯著富集的信號通路。

1.3.8 差異表達基因的qRT-PCR驗證 切取全部小鼠肝組織50 mg，加入500 μL TRIzol試劑及100 μL氯仿抽提總RNA，應用Prime ScriptTMRT試劑盒進行逆轉錄制備cDNA。以GAPDH為內參進行熒光定量PCR擴增以檢測各組肝組織中mRNA的表達水平。擴增引物由AZENTA(https://www.azenta.com)公司合成，引物序列見表1。反應條件：95 ℃、30 s預變性；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環。各組均設3個復孔。采用2-△△CT法表示各目的基因的相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列表

2 結果

2.1 高脂飲食建立NAFLD的小鼠模型 高脂飼料喂養前，對照組和模型組小鼠體質量無明顯差異[(21.73±0.45)g vs (21.93±0.67)g，t=-0.598，P=0.561)]；高脂飲食喂養7周后，與對照組相比，模型小鼠體質量增加，兩組差異無統計學意義[(26.63±2.52)g vs (31.10±3.57)g，t=-2.601，P=0.230]。對照組和模型組ALT、AST差異均無統計學意義[(32.17±4.31)U/L vs (50.25±30.08)U/L，t=-1.447，P=0.173；(85.50±38.52)U/L vs (146.13±88.52)U/L，t=-1.558，P=0.145)]。與對照組相比，模型組血清TG明顯高于對照[(2.02±0.50)mmol/L vs (1.00±0.29)mmol/L，t=-4.45，P=0.001]。HE染色結果提示：對照組小鼠肝細胞形態正常、結構完整、無脂肪變性；模型組可見肝細胞彌漫性脂肪變性和氣球樣變。油紅染色顯示：對照組肝細胞未見明顯脂滴；模型組肝細胞胞漿內橘紅色脂滴數量增多，大小不一(圖1)；模型組肝細胞脂肪變分級明顯高于對照組(1.88±0.64 vs 1.00±0.00，t=-3.86，P=0.006)(圖2)。

圖1 兩組小鼠組織病理學結果

圖2 兩組血清TG水平及肝組織脂肪變分級比較

2.2 組織表達差異基因分析 將P<0.05且基因表達量差異倍數≥2.0的基因定義為差異表達基因。與對照組相比，模型組轉錄組測序差異表達基因共1367個，其中上調和下調基因數分別為608個和759個。GO分析顯示：脂質分解代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝過程、糖異生等呈顯著富集，與NAFLD發生密切相關。差異表達基因GO富集分析前60(篩選3種分類中對應差異基因數目大于2的GO條目，按每個條目對應的qvalue 由大到小排序的各20條)條形圖展示見圖3。KEGG分析顯示：PPAR信號通路、膽固醇代謝、脂肪酸代謝等呈顯著富集，與NAFLD的發生密切相關。差異表達基因KEGG富集前30氣泡圖見圖4。

圖3 差異表達基因GO富集分析

圖4 差異表達基因KEGG富集分析

2.3 GST基因功能分析 高脂飲食誘導17個GST基因的差異表達：GSTa2、GSTa4、GSTp1、GSTp-ps、GSTo1、GSTa1、GSTt3、GSTk1、GSTm1、GSTm4、GSTp2、GSTa3、GSTz1、GSTt1、GSTt2、GSTm2、GSTm3。GO富集分析顯示：GST基因同時參與類固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、膽固醇代謝過程等多個生物學過程，與線粒體內膜、細胞器內膜、呼吸體等細胞分組相關，分子功能涉及轉移酶活性、單加氧酶活性、氧化還原酶活性等。KEGG富集分析顯示：GST基因參與藥物代謝、細胞色素P450對異生素的代謝、谷胱甘肽代謝等。GO富集分析顯示：谷胱甘肽代謝過程呈顯著富集，KEGG通路分析顯示谷胱甘肽代謝通路顯著富集，差異基因見表2。上述結果提示GST可能在高脂飲食誘導的脂肪肝模型中發揮重要作用。

2.4 差異表達基因的qRT-PCR驗證 從17個GST差異基因中選擇差異最明顯的前10個GST基因(表2)。以GAPDH作為內參，采用熒光定量PCR驗證RNA-seq結果的可靠性，差異表達基因驗證結果見圖5，與轉錄組測序差異基因變化趨勢一致，其中GSTa2、GSTa3、GSTa4、GSTm1、GSTm2、GSTm3、GSTm4、GSTp1、GSTo1表達較對照組下調，GSTk1表達上調，從而進一步證實轉錄組測序結果的可靠性。

圖5 RT-PCR驗證小鼠肝組織中差異表達基因mRNA的表達

表2 GST差異表達基因GO和KEGG富集分析

3 討論

GST曾被稱為谷胱甘肽S-轉移酶，是一組Ⅱ期解毒酶，能催化還原型谷胱甘肽與多種內源性/外源性親電子化合物結合。GST基因的遺傳多態性可參與NAFLD、不同病因的肝炎、肝硬化和肝細胞癌的發生發展[9-10]。因此，研究GST基因在NAFLD中的表達及其作用具有一定意義。

非酒精性肝脂肪變是NAFLD疾病譜之一[1]。本研究采用高脂飼料喂養7周，誘導NAFLD模型。結果發現，與對照組相比，模型組小鼠體質量與肝功能無明顯變化，HE染色和油紅染色可見肝細胞呈現小泡性脂肪變，脂肪變積分為1.88±0.64，提示NAFLD模型建立。

本研究采用RNA-seq轉錄組測序篩選高脂飲食誘導的NAFLD模型與正常小鼠差異基因，共篩選出1367個特異性差異表達基因，其中上調基因數608個、下調基因數759個。生物信息學通路分析顯示這些差異基因參與類固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、膽固醇代謝過程等多個生物學過程，與線粒體內膜、細胞器內膜、呼吸體等細胞分組相關，分子功能涉及轉移酶活性、單加氧酶活性、氧化還原酶活性等，與既往的研究一致。GO富集分析顯示谷胱甘肽代謝過程富集，KEGG通路分析顯示谷胱甘肽代謝通路富集。

已知的人類GST基因家族由六個亞家族組成：α(GSTA-alpha)、μ(GSTM-miu)、ω(GSTO-omega)、π(GSTP-pi)、θ(GSTT-theta)和ξ(GSTZ-zeta)[11]。人GST基因約有29個亞型(https://www.genecards.org)。本研究采用高脂飲食誘導的NAFLD模型發現17個GST家族基因差異表達，占人GST家族基因的58.62%，提示GST相關基因可能參與NAFLD的進展。選擇差異倍數最明顯的前10個GST相關基因，采用qRT-PCR驗證小鼠肝組織中GST相關基因表達，最終結果提示其表達水平與轉錄組測序差異分析的變化趨勢一致，進一步證實轉錄組測序結果的可靠性。

GST在細胞解毒以及保護細胞免受內源性與外源性氧化應激損傷中起著至關重要的作用[9]。GSTp1 A313G基因多態性研究表明NAFLD患者G等位的攜帶頻率更高[12]，G等位基因是NAFLD 的危險因素[13]，提示GSTp1基因多態性與NAFLD發生相關。與健康成年人相比，NAFLD患者的脂肪因子失衡，瘦素濃度升高，脂聯素水平降低[14]。Prysyazhnyuk等[15]的研究發現，與基因型正常的NAFLD 患者相比，GSTm1無效基因型患者的瘦素血漿水平顯著升高。Lan等[2]發現NASH誘導肝細胞GSTm2下調，肝細胞GSTm2通過阻斷ASK1 N端二聚化和磷酸化阻止NASH進展。GSTa4的缺失可加劇NAFLD的發生[16]，表現為肝臟脂肪變性、氧化應激，血清丙氨酸氨基轉移酶、TNFα、IL-6升高等。Nrf2是氧化應激中的關鍵轉錄因子，促進GSTa2基因的激活，提高抗氧化應激能力，與NAFLD發生密切相關[17]。然而，朱雅莉等[18]應用iTRAQ技術定量分析NASH患者肝組織中的差異蛋白發現，GSTm4在NASH患者肝組織中上調，與本研究結果相反，故GSTm4與NASH的關系，需進一步研究。此外，本研究發現高脂飲食導致GSTa3、GSTm3、GSTo1、GSTk1在NAFLD模型組中差異表達，盡管這些基因在NAFLD相關報道很少，但是GO和KEGG分析顯示這些GST基因參與抗氧化活性、氧化還原酶活性等多個與NALFD發生相關的過程，是進一步研究的方向。

本研究采用高脂飲食建立模型，其肝臟脂肪變較輕，且炎癥改變不明顯，但仍發現GST基因表達差異，提示在NAFLD發生的早期已有GST基因改變。GST通過參與類固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、膽固醇代謝過程等多個生物學過程影響脂質代謝，與NAFLD發病密切相關，后期將深入討論GST相關基因參與NAFLD的病理機制，以期為NAFLD治療提供依據。

倫理學聲明：本研究方案于2021年7月2日經由上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批，批號：PZSHUTCM210702004，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：沈婷婷負責生化檢測、數據分析與撰寫論文；朱哿瑞、王帆負責動物造模；孫鑫、黃愷負責動物病理；彭淵負責生信分析；陶艷艷、劉成海負責課題設計，擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。