間充質干細胞源性外泌體治療脊髓損傷的研究進展*

張鑫瑞,韓 悅 綜述,耿承奎 審校

(昆明醫科大學附屬延安醫院骨科,云南 昆明 650051)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是中樞神經系統的一種嚴重創傷性疾病,導致脊髓功能的損傷[1],患者表現為損傷平面以下運動和感覺的嚴重障礙。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種來源于體內多種組織,具有自我更新和多向分化的潛能的細胞[2]。外泌體(exosomes,Exos)源于MSCs,是一種細胞分泌物,較MSCs具有一定的優勢[3]。SCI主要分為原發性損傷和繼發性損傷兩個病理過程,原發性損傷是指脊髓受到外力后發生的損傷,原發性損傷后會引起繼發性損傷[4]。針對SCI的治療,目前集中治療繼發性損傷,為了減輕SCI患者的功能障礙,探索新的SCI治療方案是全球都密切關注的問題,目前Exos是對SCI治療的研究熱點,因此,本文將從MSCs來源Exos對促進SCI后神經元細胞的再生進行綜述,現報告如下。

1 脊髓損傷后神經元細胞的凋亡

細胞凋亡是細胞的程序性死亡,神經元細胞凋亡的作用機制復雜。SCI后可造成損傷區域神經元的凋亡以及局部微環境的改變,微環境的改變對神經元的修復和再生產生抑制作用,并且經過一系列復雜的反應加速了神經元的凋亡[5],脊髓神經細胞的凋亡對SCI的功能和預后起重要作用。有研究報道[6],凋亡啟動子(Caspase-1、2、4、5、8、9、10)和凋亡執行子(Caspase-3、6、7、14)在神經元細胞凋亡中都起到重要作用,可以通過作用于細胞凋亡信號通路的下游階段,激活神經元細胞的凋亡過程,導致發生凋亡,其中Caspase-3是最重要的分子。雖然通過研究已知一些和神經元細胞凋亡有關的促進因子,但是凋亡仍是一個復雜的病理生理過程,具體機制還需要進一步的研究。現在,已被報道的神經元細胞凋亡途徑有氧化應激反應、線粒體途徑和死亡受體途徑,可以為SCI后修復提供新思路。

1.1 氧化應激反應

氧化應激反應是脊髓損傷后氧化和抗氧化作用失衡的一種關系,氧化大于抗氧化作用,以大量自由基生成為特征,產生負面作用,導致神經元細胞凋亡的發生[7]。在一般情況下,各組織細胞可產生抗氧化酶清除產生的自由基,避免自由基對所在的組織器官帶來損害,但脊髓損傷后,自由基的生成量超出抗氧化酶的清除范圍,導致自由基大量存在于SCI處,對神經元產生損害,最終對脊髓造成繼發性損傷。抑制氧化應激反應可以對SCI后神經元起到保護的作用。

1.2 線粒體途徑

線粒體是存在于大多數細胞中的半自主細胞器,能對細胞產生供能的作用,并參與細胞中的多種反應。脊髓損傷后,神經元細胞中產生的信號誘導線粒體中的細胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)釋放到基質中,引起凋亡蛋白酶活化因子-1(Apoptotic Protease Activating Factor-1,APAF-1)激活半胱天冬酶-9(Caspase-9),導致凋亡蛋白酶即半胱天冬酶-3(Caspase-3)被激活,引起神經元細胞的凋亡。當線粒體通透性增加時,引起膜內Cyt-C的快速釋放,加速了神經元細胞的凋亡進程[8]。

1.3 死亡信號途徑

死亡信號途徑在神經細胞凋亡中發揮著重要作用,死亡信號途徑中重要的介導因子是調亡相關因子(Factor associated suicide,Fas),Fas是腫瘤壞死因子受體家族(Tumor Necrosis Factor Receptor,TNFR)中的一種蛋白,通過跨膜傳遞信號,其在I型受體細胞基質中的結構稱為死亡結構域(Death Domain,DD),可傳遞神經元細胞凋亡的信號,Fas可與配體在DD結合,直接作用于Caspase家族中的一些分子,經過一系列反應激活Caspase-3,導致神經元細胞凋亡的發生。

2 間充質干細胞治療脊髓損傷

MSCs來源于多能干細胞,是一類具有自我更新和多向分化潛能的基質細胞,因其增值能力強、來源廣泛、易于分離和保存等特點,被廣泛運用于各項基礎研究和臨床研究,MSCs通過多種機制修復SCI,對SCI后神經元細胞的再生和神經功能恢復具有促進作用。脊髓損傷后造成了損傷區域神經元細胞的丟失和凋亡,并產生對神經元細胞再生有抑制作用的微環境,MSCs移植可促進神經元細胞修復和再生,分化為具有特定功能的神經細胞替代損傷的神經細胞,還可通過旁分泌產生抗炎、抗氧化應激、抗凋亡、促進營養物質釋放的作用[9],調節微環境,促進軸突生長。但有研究顯示[10],MSCs移植具有存活率低、靶向性差、成瘤性和低神經元分化性,并且在脊髓損傷微環境中細胞存活時間短等,所以在臨床應用MSCs具有不穩定性和不安全性等。

3 間充質干細胞來源的外泌體

Exos來源于胞內體,細胞膜內陷形成胞內體,早期形成的胞內體在活性物質的積累和其他蛋白質的參與下形成晚期胞內體,最終形成多囊泡體,多囊泡體與細胞膜融合后釋放到細胞外,形成直徑為40～100nm的細胞外小囊泡,內含核酸、蛋白質、脂質、細胞因子、轉錄因子受體和生物活性物質[11]。在使用MSCs的早期,Exos被當作細胞代謝的無關物質,一直都未對其進行深入研究,直到最近幾年,外泌體的作用才逐漸被人們所關注。Exos經過細胞的旁分泌后與靶細胞的受體相結合,傳遞細胞間信號并將所攜帶的物質運輸至靶細胞,從而調節細胞的功能。間充質干細胞來源的外泌體(MSCs-Exos)被用于多領域的研究并取得了一定的療效,但在脊髓損傷中運用的研究還處于早期階段。MSCs-Exos和MSCs有相似的功能,但MSCs-Exos較MSCs具有穩定性高、劑量和濃度易于控制、易于運輸和貯存并且無免疫排斥反應等特點,使其在SCI的治療中更具有優勢。

4 MSCs-Exos治療脊髓損傷

MSCs-Exos對SCI的治療在近幾年來受到人們的關注,脊髓損傷后導致脊髓周圍的血管破裂、出血、神經元細胞的軸突斷裂,造成瓦勒變性,進而加重軸突壞死、髓鞘分解,從而抑制軸突再生[12]。脊髓損傷后,在原發性損傷的基礎上發生繼發性損傷,加重了損傷的嚴重程度,對損傷的預后起著重要作用,研究發現[13],MSCs-Exos中的微小RNA(MicroRNA,miRNA)能改善繼發性損傷,促進神經元細胞的修復和再生。

4.1 MSCs-Exo抑制脊髓損傷后的炎癥反應

有研究發現[14]用骨髓干細胞來源的外泌體(BMSCs-Exos)對SCI大鼠和小膠質細胞進行處理,結果抑制了促炎因子水平,并提高了大鼠的運動功能,在大鼠的神經元細胞中發現miRNA-181c的水平升高并且核因子信號的磷酸化水平受到抑制,說明BMSCs-Exos可以抑制細胞的炎癥反應,從而保護受損的神經元細胞。當中樞神經系統(Central Nervous System,CNS)受損時,處于靜息狀態的星形膠質細胞就會向起到促進神經元細胞的凋亡、抑制軸突生長作用的A1型星形膠質細胞進行轉化,有研究表明[15]在SCI后BMSCs-Exos抑制A1型星形膠質細胞的轉化,從而減少了脊髓損傷部位的炎癥反應,降低了TNF-α、C3等促炎因子的表達水平,說明BMSCs-Exos可通過抑制星形膠質細胞向A1型轉化,從而起到保護神經元細胞的作用。

4.2 MSCs-Exo抑制脊髓損傷后的細胞凋亡

一般來說,神經細胞受損發生凋亡后是不能再生的,脊髓損傷后神經元出現一系列反應后導致細胞凋亡。miRNA是一類由內源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子,能參與生物體內的病理生理過程,對細胞的生長發育起到重要作用,miRNA與SCI后神經元細胞凋亡、炎癥、氧化應激等反應密切相關[16]。有研究證明了[17]將含有miRNA-544的MSCs-Exo注射到SCI大鼠模型中,并分析了其組織的促炎因子的水平,結果顯示注射了含miRNA-544的MSCs-Exo大鼠神經元細胞的丟失和凋亡減少,并且促進了大鼠神經功能的恢復。

4.3 MSCs-Exo促進脊髓損傷后神經細胞軸突的生長

神經元細胞軸突的生長在脊髓損傷后神經修復和再生中起著重要作用,生長相關蛋白43(Growth-associated protein,GAP-43)和神經絲蛋白200(Neurofilament protein,NF-200)是軸突生長的重要蛋白。研究表明[18],BMSCs-Exos通過作用于STAT3/GAP-43通路,改善SCI后大鼠的感覺功能,結果顯示注射了BMSCs-Exos的大鼠細胞中NF-200染色陽性的數量增加,轉錄激活因子3(Signal transducers and activators of transcription,STAT3)和生長相關蛋白43(GAP-43)的表達增加,說明BMSCs-Exos能通過作用于STAT3/GAP-43通路改善大鼠的感覺功能,促進軸突再生,進而促進神經元細胞的修復和再生。SCI后軸突的生長并不是只有一種形式,也不只受單個因素影響,因此,不同程度的脊髓損傷需要用不同的治療方案來促進其軸突的再生。

5 討論

脊髓損傷后會導致多系統的功能障礙,并且出現繼發性損傷,嚴重影響患者的生活質量,為了攻克這一難題,研究人員對SCI患者提出了諸多治療方案,但臨床效果并不明顯。近年來,間充質干細胞來源Exos治療SCI逐漸被人們所重視,Exos與MSCs相比具有較高的存活率和低免疫原性等優勢,被廣泛運用于各個領域的研究。Exos對脊髓損傷后神經元細胞的修復和再生有良好的促進作用,對損傷局部微環境有改善效果,因此對SCI小鼠治療效果明顯,也可作為載體靶向治療疾病。因Exos被關注的時間比較晚,大部分實驗還處于基礎研究階段,其作用和功能需進一步探索,但其有望成為今后臨床治療脊髓損傷后神經恢復的有效治療手段。