翁 甜,王昱晴,龍超安
(華中農業大學園藝林學學院,園藝植物生物學教育部重點實驗室,國家柑橘保鮮技術研發專業中心,湖北 武漢 430070)
柑橘是全球產量最高的水果之一,因其豐富的營養價值深受消費者的喜愛。然而,柑橘極易受病原菌的侵害,其中柑橘酸腐病是柑橘采后病害中僅次于綠霉病和青霉病的一大真菌病害,由半知菌亞門地霉屬真菌酸腐病菌(Geotrichum citri-aurantii)引起[1-2]。該菌通常由果實傷口侵入,參與細胞外內聚半乳糖醛酸酶的分泌,浸漬果實組織,同時會傳播至臨近的正常果實,造成果實間的交叉侵染,引起大面積果實腐爛,造成嚴重經濟損失[3]。
目前,防治柑橘采后真菌病害的有效措施主要是使用化學合成殺菌劑,例如抑霉唑、噻苯咪唑、嘧霉胺、咪鮮胺等[4]。然而,現階段針對柑橘酸腐病菌的殺菌劑種類極少,且殺菌劑的大量使用會造成嚴重的環境污染,增強病原菌的抗藥性,同時殺菌劑帶來的農藥殘留對人體健康有害[5]。雙弧鹽對酸腐病菌有明顯的抑制作用,能夠顯著降低柑橘酸腐病的發生,但長期使用可能會影響人類健康,在一些國家和地區已被禁止使用[6]。因此,尋找安全有效的方法以防治柑橘酸腐病十分必要。
香葉醇又稱牻牛兒醇,是一種天然的無環類異戊二烯單萜,存在于許多不同的植物精油中,例如玫瑰、檸檬草、薰衣草、酸橙等[7-8]。近年來,大量的研究表明,香葉醇具有多種生物和藥理特性,例如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗微生物、護肝、神經保護等[7]。Su Yuwen等[9]研究發現香葉醇能夠通過抑制COX-2來抑制炎癥。El-Bassossy等[10]研究發現,香葉醇可以通過抑制氧化應激來發揮心臟保護作用。de Oliveira Pereira等[11]研究發現香葉醇對紅色毛癬菌的細胞壁和細胞膜有損傷作用,對紅色毛癬菌具有抗真菌活性。Singh等[12]研究發現香葉醇對白色念珠菌的細胞膜形成和菌絲形態發生具有抑制作用,同時能夠破壞線粒體功能及鐵的穩定性,降低遺傳毒素的毒性。此外,香葉醇還具有抗潰瘍、驅蚊、防腐、增甜等作用[13]。多項研究表明,香葉醇是一種純植物化合物,無副作用,主要通過調節蛋白質表達來發揮多種活性,現已被美國食品和藥物管理局批準作為食品添加劑來改善飲料、糖果和冰淇淋的風味[14]。
關于香葉醇的抗菌特性研究主要集中在對細菌性及人類真菌性病害方面,對植物源真菌的抗性研究較少。本實驗以酸腐病菌為材料,研究香葉醇對酸腐病菌的抑菌作用,進一步探討香葉醇對酸腐病菌的抑菌機制,旨在為柑橘酸腐病的防治提供參考。
酸腐病菌AY-1菌株由本實驗室分離并保藏,在PDA培養基上活化后用于后續實驗。
溫州蜜柑(Citrus unshiu) 華中農業大學柑橘園。
香葉醇(純度98%) 上海麥克林生化科技有限公司;鈣熒光白(calcofluor white,CFW)試劑、碘化丙啶(pyridine iodide,PI)試劑 美國Sigma公司;2,7-二氯熒光素二氫二乙酸酯(2,7-dichlorodihydr of luorescein diacetate,DCFH-DA)試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)試劑盒 上海索萊寶生物科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所。
UV-1500紫外分光光度計 翱藝儀器(上海)有限公司;DL-CJ-IMD-II潔凈工作臺 北京東聯哈爾冰儀器制造有限公司;Centrifuge高速離心機 德國Eppendorf公司;Eclipse E100生物顯微鏡、Eclipse 90i正置生物顯微鏡 日本Nikon公司;DDS-307A電導率儀 上海雷磁儀器有限公司;生化培養箱 武漢瑞華儀器設備有限責任公司;VICTOR Nivo多功能酶標儀 美國Perkin Elmer公司;H-7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司。
1.3.1 菌株活化
吸取2.5 μL凍存(-80 ℃)于甘油管中的酸腐病菌AY-1菌液接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基上,置于28 ℃培養3~4 d,備用。
1.3.2 孢子懸浮液的配制
取1.3.1節培養3~4 d的酸腐病菌AY-1,挑取菌絲至1 mL無菌水中,充分搖勻后用血球計數板計數,然后用無菌水調整孢子懸浮液濃度分別為1h 105個/mL和1h 106個/mL,備用。
1.3.3 香葉醇處理對酸腐病菌的抑菌活性測定
參考Yang Shuzhen等[15]的方法測定香葉醇對酸腐病菌的抑菌活性。在PDA培養基中加入香葉醇使其終質量濃度分別為0.125、0.250、0.500、1.000 g/L,以不添加香葉醇為對照(CK)組,將PDA培養基倒入直徑為90 mm的培養皿中,待其凝固。取1.3.1節活化后的酸腐病菌AY-1平板,用打孔器取直徑6 mm酸腐病菌AY-1菌餅,將菌餅置于PDA培養基中央,在25 ℃恒溫培養箱中培養,每24 h觀察菌落生長情況并拍照,采用十字交叉法測量菌落直徑,共培養5 d。將48 h內完全無菌絲生長的質量濃度作為最小抑菌質量濃度(minimal inhibitory concentration,MIC),96 h內完全無菌絲生長的質量濃度作為最小殺菌質量濃度(minimal fungicidal concentration,MFC)[16]。
1.3.4 酸腐病菌孢子萌發率測定
參考潘佳亮[17]的方法并稍作改動測定酸腐病菌的孢子萌發率。取1.3.1節培養3~4 d的酸腐病菌AY-1,挑取菌絲至馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基(potato dextrose broth,PDB)中,用PDB調整孢子終濃度為1h 106個/mL,加入終質量濃度0、1/2 MIC、MIC的香葉醇,于搖床中振蕩培養(25 ℃、150 r/min,下同)12 h后置于Eclipse E100生物顯微鏡下觀察孢子萌發情況,按式(1)計算孢子萌發率。

1.3.5 酸腐病菌菌絲體細胞壁完整性分析
1.3.5.1 CFW試劑染色
參考Ouyang Qiuli等[18]的方法并稍作改動,觀察酸腐病菌菌絲體細胞壁的完整性。取0.5 mL 1.3.2節1h 106個/mL酸腐病菌孢子懸浮于50 mL PDB中,搖床培養2 d,5000 r/min離心20 min收集菌絲體,取1 g菌絲體加入30 mL無菌水中,加入香葉醇使其終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC,以不添加香葉醇為對照組。處理6 h后,取少量菌絲體于2 mL離心管中,加入10 μL CFW試劑處理10 s,再加入等體積的質量分數10% NaOH溶液,于Eclipse 90i正置生物顯微鏡下觀察。
1.3.5.2 AKP活力測定
參照1.3.5.1節方法處理0、3、6、9、12 h后收集不同處理組和對照組的菌絲體,加入提取液,充分研磨,4 ℃、10000 r/min離心10 min,取上清液根據試劑盒說明書步驟測定AKP活力。
1.3.6 酸腐病菌菌絲體細胞膜完整性分析
1.3.6.1 PI染色
參考Ouyang Qiuli等[19]的方法稍作改動觀察酸腐病菌菌絲體細胞膜的完整性。參照1.3.5.1節方法處理菌絲體6 h,取少量菌絲體于2 mL離心管中,加入500 μL PI染色液,37 ℃水浴避光染色10 min,用PBS沖洗3 次,去除多余染色液,于Eclipse 90i正置生物顯微鏡下觀察。
1.3.6.2 相對電導率測定
參考Wang Wenjun等[20]的方法稍作改動測定酸腐病菌菌絲體的胞外相對電導率。取0.5 mL 1.3.2節1h 106個/mL酸腐病菌孢子懸浮于50 mL PDB中,搖床培養2 d,5000 r/min離心20 min收集菌絲體,稱取1 g菌絲于50 mL離心管中,加入30 mL去離子水重懸菌絲,加入香葉醇使其終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC,以不添加香葉醇為對照組。用DDS-307A電導率儀測定0、2、4、6、8、10、12 h酸腐病菌的胞外電導率L/(μS/cm),初始電導率為L0/(μS/cm),12 h后將其煮沸10 min后冷卻至室溫,再次測定電導率L’/(μS/cm)。并按式(2)計算相對電導率。

1.3.6.3 核酸泄漏水平測定
參考Wu Yalan等[21]的方法稍作改動測定酸腐病菌菌絲體核酸的泄漏情況。參照1.3.5.1節方法處理菌絲體0、2、4、6、8、10、12 h后取上清液于12000 r/min離心10 min,采用紫外分光光度計測定260 nm波長處吸光度,以表征菌絲體核酸的泄漏情況。
1.3.7 透射電子顯微鏡觀察
取0.5 mL 1.3.2節1h 106個/mL孢子懸浮液于50 mL PDB中,搖床振蕩培養24 h,加入香葉醇使其終質量濃度為MIC,以不添加香葉醇為對照組,繼續振蕩24 h,收集菌絲并將其加入到體積分數2.5%戊二醛溶液中固定,使用透射電子顯微鏡觀察。
1.3.8 酸腐病菌菌絲體丙二醛含量測定
參照1.3.5.1節方法處理0、3、6、9、12 h后收集不同處理組和對照組的菌絲體,根據MDA試劑盒說明書操作測定酸腐病菌菌絲體內MDA的含量。
1.3.9 酸腐病菌菌絲體活性氧水平測定
參照1.3.5.1節方法處理6 h后收集不同處理組和對照組的菌絲體,根據DCFH-DA試劑盒說明書檢測菌絲體胞內活性氧水平。
1.3.10 柑橘果實活體接種效果分析
參考Wang Wenjun等[22]的處理方法,選取體積、質量相近且無明顯機械損傷的柑橘果實,先用自來水沖洗1 次,然后用質量分數2%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min,最后用蒸餾水沖洗3 次,室溫下于超凈臺中自然晾干。在每個果實赤道附近用接種針刺出3 個等距離的傷口(直徑約為5 mm,深度約為3 mm)。用無菌水配制菌藥混合液(含1h 105個/mL酸腐病菌孢子懸浮液和不同質量濃度(MIC、10 MIC、20 MIC)香葉醇)。吸取10 μL菌藥混合液接種于傷口處,待傷口自然吸收,同時設置對照組(10 μL 1h 105個/mL酸腐病菌孢子懸浮液)。將接種后的果實放置于經體積分數75%乙醇溶液消毒處理的保鮮盒(30 cmh 21 cmh 12 cm)中,果實底部用無菌塑料蓋或玻璃小皿支撐,保鮮盒中加入適量無菌水以控制相對濕度。將保鮮盒室溫放置7 d,每隔24 h觀察果實發病情況,計算第3、4、5、6、7天的果實發病率(病果數/總果數×100%)并測定發病果實的病斑直徑。
實驗設置3 個平行,結果以平均值±標準差表示。數據用Excel 2016軟件和SPSS Statistics 25軟件進行統計分析,采用Duncan檢驗進行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,采用Excel 2016軟件作圖。
如圖1所示,不同質量濃度的香葉醇處理對酸腐病菌有不同程度的抑制作用,且抑制作用隨處理質量濃度的升高而增強。對照組培養5 d后菌落直徑達到(74.57f 1.39)mm,而0.125、0.250 g/L香葉醇處理組菌落直徑僅分別為(48.62f 1.47)、(40.66f 2.25)mm,0.500、1.000 g/L香葉醇處理組酸腐病菌未生長。培養2 d后,0.500 g/L的香葉醇處理即可顯著抑制酸腐病菌的生長,表明香葉醇抑制酸腐病菌生長的MIC為0.500 g/L;培養4 d后,0.500 g/L的香葉醇仍能完全抑制酸腐病菌的生長,表明香葉醇抑制酸腐病菌生長的MFC為0.500 g/L。

圖1 香葉醇處理對酸腐病菌菌絲體生長的影響Fig.1 Effect of geraniol treatment on mycelia growth in G.citri-aurantii
如圖2所示,與對照組相比,不同質量濃度的香葉醇處理后酸腐病菌孢子萌發率顯著降低(P<0.05)。處理12 h后,對照組孢子萌發率達到(92.17f 1.88)%,而1/2MIC和MIC處理組的孢子萌發率僅分別為(5.07f 2.03)%和(3.28f 1.28)%,表明香葉醇處理可以顯著抑制酸腐病菌孢子的萌發。

圖2 香葉醇處理對孢子萌發的影響Fig.2 Effect of geraniol treatment on spore germination
2.3.1 CFW試劑染色觀察結果
CFW試劑能夠與真菌細胞壁中的幾丁質結合產生藍色熒光,當熒光減弱時,說明真菌細胞壁完整性遭到破壞。如圖3所示,用1/2 MIC和MIC的香葉醇處理菌絲體6 h后,藍色熒光明顯減弱,而對照組藍色熒光明亮,表明經香葉醇處理的菌絲體細胞壁完整性被破壞,細胞壁中的成分發生改變。

圖3 香葉醇處理對酸腐病菌菌絲體細胞壁的影響Fig.3 Effect of geraniol treatment on mycelial cell wall in G.citri-aurantii
2.3.2 AKP泄漏情況
如圖4所示,不同質量濃度的香葉醇處理能夠引起酸腐病菌AKP活力發生明顯變化。培養3 h后,經香葉醇處理后的酸腐病菌AKP活力顯著高于對照組(P<0.05),培養12 h后,對照組AKP活力仍處在較低水平,1/2 MIC香葉醇處理的AKP活力達到對照組的3.27 倍,MIC香葉醇處理的AKP活力達到對照組的6.86 倍,均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖4 香葉醇處理對酸腐病菌菌絲體AKP泄漏的影響Fig.4 Effect of geraniol treatment on leakage of AKP in G.citri-aurantii mycelia
2.4.1 PI染色觀察結果
細胞膜是真菌的基本組織結構,能夠維持真菌正常的生理結構,同時能夠有效調節菌絲體內外環境的穩態。PI染色液不能穿過活細胞膜,而能穿過破損的細胞膜與雙鏈DNA結合產生紅色熒光[23]。如圖5所示,用1/2 MIC和MIC香葉醇處理菌絲體6 h后,通過熒光顯微鏡觀察發現菌絲體產生紅色熒光,對照組無熒光產生,表明經香葉醇處理的菌絲體細胞膜完整性被破壞。

圖5 香葉醇處理對菌絲體細胞膜的影響Fig.5 Effect of geraniol treatment on mycelia cell membrane
2.4.2 相對電導率變化
如圖6所示,不同質量濃度的香葉醇處理后酸腐病菌相對電導率隨處理時間的延長而呈上升趨勢。處理2 h后,對照組與處理組之間存在顯著差異(P<0.05)。隨著處理時間的延長,不同質量濃度香葉醇處理之間均存在顯著差異(P<0.05),質量濃度越高,相對電導率越高,表明對酸腐病菌細胞膜的破壞作用越大。

圖6 香葉醇處理對酸腐病菌菌絲體相對電導率的影響Fig.6 Effect of geraniol treatment on relative conductivity in G.citri-aurantii mycelia
2.4.3 核酸泄漏水平
如圖7所示,香葉醇處理會導致菌絲體核酸的泄漏。在0~12 h內,對照組核酸無明顯泄漏情況,而經香葉醇處理的菌絲體核酸泄漏量明顯上升,始終高于對照組,表明香葉醇處理破壞了菌絲體的細胞膜,促進了菌絲體內核酸的外泄。

圖7 香葉醇處理對酸腐病菌菌絲體核酸泄漏水平的影響Fig.7 Effect of geraniol treatment on leakage of nucleic acid in G.citri-aurantii mycelia
如圖8所示,香葉醇處理后酸腐病菌受到嚴重破壞。對照組細胞完整均勻,細胞壁與細胞膜緊密相連,可見明顯的細胞器,處理組菌絲體發生質壁分離,細胞壁被破壞,且有增厚現象,細胞膜皺縮,細胞質被降解,細胞內呈現空泡化。

圖8 香葉醇處理后酸腐病菌菌絲體透射電子顯微鏡圖Fig.8 TEM of G.citri-aurantii mycelia after geraniol treatment
MDA是膜脂過氧化的主要產物,能夠衡量菌絲體的膜脂過氧化水平。如圖9所示,對照組MDA濃度在12 h內無明顯變化,與對照組相比,相同時間不同質量濃度的香葉醇處理組酸腐病菌菌絲體MDA濃度顯著上升(P<0.05),且香葉醇處理組MDA濃度維持在較高水平。

圖9 香葉醇處理對酸腐病菌菌絲體MDA濃度的影響Fig.9 Effect of geraniol treatment on malondialdehyde content in G.citri-aurantii mycelia
DCFH-DA本身無熒光,可以穿透細胞膜,進入細胞后,可以在細胞內的酯酶作用下水解成2’,7’-二氯二氫熒光素,而2’,7’-二氯二氫熒光素不能穿透細胞膜,細胞內的活性氧與2’,7’-二氯二氫熒光素反應產生具有綠色熒光的2’,7’-二氯熒光素,且綠色熒光強度與活性氧水平成正比[16]。如圖10所示,用1/2 MIC和MIC香葉醇處理酸腐病菌菌絲體6 h后,菌絲體產生綠色熒光,而對照組無熒光產生,說明經處理后菌絲體內活性氧水平增加。

圖10 香葉醇處理對酸腐病菌菌絲體活性氧的影響Fig.10 Effect of geraniol treatment on ROS levels of G.citri-aurantii mycelia
將香葉醇與柑橘酸腐病菌孢子懸浮液混合后立即接種于果實表面,如圖11所示,不同質量濃度的香葉醇對果實表面酸腐病菌的抑菌效果存在差異。對照組果實在第2天開始發病,處理組果實隨處理濃度的升高,發病時間越遲。接種3 d后,對照組果實病斑直徑達14.52 mm,MIC條件下果實病斑直徑達13.11 mm,與對照組之間無顯著差異(P>0.05),而10 MIC、20 MIC條件下果實均未發病。隨著接種時間的延長,對照組果實病斑直徑擴展迅速,接種7 d后,對照組果實病斑直徑為39.99 mm,發病率達72.69%,MIC、10 MIC、20 MIC處理組病斑直徑依次為31.62、28.33、27.84 mm,發病率依次為45.83%、21.53%、11.11%,均顯著低于對照組(P<0.05)。說明香葉醇處理能夠抑制果實柑橘酸腐病的發生。


圖11 香葉醇處理柑橘果實發病情況Fig.11 Effect of geraniol treatment on incidence of sour rot in citrus fruit
本實驗主要研究了香葉醇對酸腐病菌的抑菌機制。抑菌活性測定表明香葉醇對酸腐病菌具有明顯的抑制作用。香葉醇在質量濃度為0.125~1.000 g/L之間對酸腐病菌具有不同程度的抑制作用,MIC為0.500 g/L,此時酸腐病菌孢子萌發率僅為(3.28f 1.28)%,基本抑制了酸腐病菌孢子的萌發。這與其他天然植物提取物的抑菌作用相似,例如檸檬醛和辛醛對酸腐病菌的MIC為0.50 μL/mL[24],黑香菜油和茴香油在400 μL/L和600 μL/L時能夠完全抑制李子灰霉病菌的生長,從而有效控制灰霉病對李子果實的感染[25]。
細胞壁是真菌抵抗外源物質入侵的第一道屏障,細胞壁的完整性對維持真菌細胞的正常生命活動至關重要,真菌細胞壁主要由幾丁質、纖維素、葡聚糖和脫乙酰殼聚糖組成[26]。真菌細胞壁的破壞可以通過觀察幾丁質的變化來驗證,幾丁質可以與CFW結合產生藍色熒光[27],當細胞壁被破壞,幾丁質含量降低,CFW無法與幾丁質結合,藍色熒光將減弱。本研究中,經1/2 MIC和MIC香葉醇處理的酸腐病菌菌絲體藍色熒光強度減弱,表明處理后的酸腐病菌菌絲體細胞壁完整性被破壞。這與鹽酸小檗堿對指狀青霉細胞壁的作用一致[28]。AKP存在于細胞壁與細胞膜之間,本研究進一步測定了AKP的泄漏情況,結果發現,對照組的酸腐病菌AKP泄漏量較低,12 h后胞外AKP活力僅為0.03 U/g,1/2 MIC和MIC香葉醇處理12 h后胞外AKP活力分別達到0.10 U/g和0.22 U/g,顯著高于對照組(P<0.05),且隨處理時間的延長,胞外AKP活力不斷升高,這與毛霉對指狀青霉和酸腐病菌的作用結果[29]相一致。
細胞膜是真菌組織結構的一部分,能夠維持真菌正常的生理結構,是細胞與外界環境進行物質交換和信息傳遞的重要通道,能夠有效調節內外環境的穩態,保障真菌的正常生命活動[30],同時,細胞膜是抗真菌劑藥物開發的重要作用靶點[31]。已有研究表明,許多抗菌物質均能夠通過改變真菌細胞膜的通透性來破壞真菌內外環境的穩態,從而起到抑菌作用,例如苦參堿[16]、百里酚、水楊酸[32]以及碳酸銨[33]等,與本研究結果相同。經香葉醇處理后,細胞膜被破壞,菌絲體胞外相對電導率顯著上升(P<0.05),細胞膜通透性增強,菌絲體細胞內核酸發生外泄,且隨著處理質量濃度的升高和處理時間的延長,核酸外泄增多,PI染色結果也證實了香葉醇對酸腐病菌細胞膜的破壞作用,這與El-Bassossy[10]以及Bound[34]等的研究結果相同,香葉醇通過細胞內物質的泄漏來破壞細胞膜,以治療紅色毛癬菌的感染,萜類物質香芹酚及其2,3-不飽和1-O-葡萄糖苷對白念珠菌細胞有裂解作用,能夠破壞細胞膜的完整性。進一步通過透射電子顯微鏡觀察也發現,香葉醇對酸腐病菌的細胞壁和細胞膜以及細胞器均有破壞作用。
細胞膜的主要成分是脂質和蛋白質,脂質中含有不飽和雙鍵,易發生脂質過氧化反應[35],MDA是膜脂質過氧化反應的重要產物之一,其對生物膜具有損傷作用[36]。活性氧是生物體內氧化代謝的產物,在調節生物體的各種生理功能中具有重要作用,但過高的活性氧水平會對細胞產生傷害,造成細胞死亡[37]。已有研究表明,經碳酸氫鉀處理后灰霉菌體內活性氧積累,對灰霉菌產生抑制作用[38]。Yang等[39]研究發現戊二醛處理誘導酸腐病菌細胞內積累大量活性氧,且MDA含量顯著高于對照組,表明菌絲體發生了脂質過氧化反應。這與本研究的結果相似,經1/2 MIC和MIC香葉醇處理后,酸腐病菌菌絲體內MDA含量顯著高于對照組(P<0.05),同時通過熒光顯微鏡可以觀察到明顯的綠色熒光,菌絲體內活性氧發生積累,表明香葉醇處理后菌絲體發生脂質過氧化反應。
本研究結果表明,香葉醇處理能夠有效抑制酸腐病菌菌絲生長和孢子萌發,0.500 g/L的香葉醇可有效抑制酸腐病菌菌絲的生長,孢子萌發率僅為(3.28f 1.28)%,能夠破壞菌絲體的細胞壁和細胞膜,增加細胞的通透性,同時造成活性氧積累,使菌絲體發生脂質過氧化反應,導致菌絲體內外環境失衡,影響菌絲體的正常生命活動。香葉醇能夠顯著減少柑橘果實酸腐病的發生,降低果實的發病率及病斑直徑,本實驗可為柑橘采后酸腐病的防治提供理論依據。