尼古丁促進高糖高脂誘導的心肌細胞凋亡的機制研究*

趙靜，郭蕊，孟芝君，劉彩紅，謝耀麗，劉晶，曹濟民，王亞靜

（1.山西醫科大學 基礎醫學院，山西 太原 030000；2.山西醫科大學附屬人民醫院 檢驗科，山西 太原 030012；3.山西醫科大學第二醫院 內分泌科，山西 太原 030001）

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy,DCM）是糖尿病患者的一種特殊心臟表現，其特征是早期的左心室肥大和舒張功能障礙，晚期出現明顯的心力衰竭和收縮功能降低[1]。吸煙是心血管疾病和2 型糖尿病的獨立危險因素[2-3]。尼古丁是香煙煙霧的主要成分，是最具藥理活性的成分之一[4]。有研究已證明長期暴露于高水平尼古丁是誘發和促發包括心肌病和周圍血管疾病在內的心血管疾病的致病因素[5]。目前尼古丁促進DCM 的機制還有待探究。有研究顯示，細胞色素酶P4501A1（Cyp1a1）和神經元乙酰膽堿受體β4 亞基（Chrnb4）的表達與突變與吸煙密切相關[6-7]，但這2 個基因是否促進DCM進展，目前尚未報道。本研究擬制備高糖/高脂細胞模型（糖尿病模型）進行細胞實驗，旨在探討尼古丁對DCM 的影響及Cyp1a1 和Chrnb4 在其中的作用機制，為吸煙人群中DCM 患者的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

H9C2 細胞（BNCC353655，商城北納創聯生物科技有限公司），DMEM 完全高糖培養基（KGM12800S，江蘇凱基生物技術有限公司），胰蛋白酶消化液（T1300，北京索萊寶科技有限公司），1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）（0.01 moL，pH 7.4）（KGB5001，江蘇凱基生物技術有限公司），葡萄糖（G116307，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），棕櫚酸酯（HY-N2341，美國MCE 公司），尼古丁（54-11-5，成都德思特生物技術有限公司），AMPK 抑制劑（P5499-5MG，美國Sigma-Aldrich 公司），DCFHDA（HY-D0940，美國MedChemExpress 公司），Cyp1a1和Chrnb4 干擾質粒（上海吉凱基因化學技術公司），凋亡試劑盒（AP105-100kit，杭州聯科生物技術股份有限公司），Reactive Oxygen Species Assay Kit（KGT010-1100 assays，江蘇凱基生物技術股份有限公司），JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（BB-4105，上海貝博生物科技有限公司），丙二醛（Malondialdehyde,MDA）試劑盒（MM-0385R1，武漢酶免生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）試劑盒（MM-0386R1，武漢酶免生物科技有限公司），ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711-02，南京諾唯贊生物科技股份有限公司），超純RNA 提取試劑盒（CW0581M）、Trizon Reagent（CW0580S，江蘇康為世紀生物科技股份有限公司），HiScript Ⅱ Q RT SuperMix（R223-01）、SYBR qPCR Master Mix（Q711-02，南京諾唯贊生物科技股份有限公司），50×TAE 緩沖液（T1060，北京索萊寶科技有限公司），6×DNA Loading Buffer（GH101-01，北京全式金生物技術股份有限公司），50 bp DNA Ladder[MD108，天根生化科技（北京）有限公 司]，Gsafe Red plus 核酸染料（GK20002，美 國GLPBIO 公司），瓊脂糖粉（75510-019，美國Invitrogen公司），RIPA 細胞裂解液（C1053，北京普利萊基因技術有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（CW0014S，江蘇康為世紀生物科技股份有限公司），GAPDH（TA-09，北京中杉金橋生物技術有限公司，1/2 000），Anti Cyp1a1（DF3565，1/500）、Anti Chrnb4（DF9698，1/500）、Anti p-AMPK（AF3423，1/500）、Anti Casepase-2（DF2908，1/500）、Anti Casepase-3（AF6311，1/500）、Anti Casepase-9（AF6348，美國Affinity 公司，1/500），免疫球蛋白G（H+L）（ZB-2301，北京中杉金橋生物技術有限公司，1/2 000），流式細胞分析儀[NovoCyte 2060R，艾森生物（杭州）有限公司]，PCR 儀[CFX Connect?，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]，蛋白電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠），化學發光成像系統[Chemi DocTM XRS+，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]。

1.2 細胞分組

根據不同的方法，將細胞分為對照組、尼古丁組、高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖高脂模型組。對照組正常培養，不做處理；尼古丁組在對照組基礎上添加6 μmoL/L 尼古丁處理26 h；高糖/高脂模型組在對照組基礎上添加33.3 mmoL/L 葡萄糖和500 μmoL/L 棕櫚酸酯共同處理24 h；尼古丁+高糖高脂模型組在對照組基礎上添加6 μmoL/L 尼古丁處理2 h 后，用33.3 mmoL/L 葡萄糖和500 μmoL/L 棕櫚酸酯共同處理24 h[8]。

用Cyp1a1基因驗證細胞實驗分組，將細胞分為shRNA-NC 組、shRNA-Cyp1a1 組、AMPK 抑制劑組、shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組。shRNA-NC 組采用H9C2 細胞轉染shRNA-NC 質粒48 h；shRNA-Cyp1a1組采用H9C2 細胞轉染shRNA-Cyp1a1 質粒48 h；AMPK 抑制劑組采用AMPK 抑制劑Dorsomorphin-2HCl 處理H9C2 細胞24 h；shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組采用H9C2 細胞轉染shRNA-Cyp1a1 質粒48 h后，添加AMPK 抑制劑Dorsomorphin-2HCl 處理細胞24 h。

用Chrnb4基因驗證實驗分組，將細胞分為shRNA-NC 組、shRNA-Chrnb4 組、AMPK 抑制劑組、shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組。shRNA-NC 組采用H9C2 細胞轉染shRNA-NC 質粒48 h；shRNA-Chrnb4組采用H9C2 細胞轉染shRNA-Chrnb4 質粒48 h；AMPK 抑制劑組采用AMPK 抑制劑Dorsomorphin-2HCl 處理H9C2 細 胞24 h；shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組采用H9C2 細胞轉染shRNA-Chrnb4 質粒48 h后，添加AMPK 抑制劑Dorsomorphin-2HCl 處理細胞24 h。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞術檢測細胞活性氧（ROS）水平 按照1 ∶1 000 用無血清培養基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L；收集細胞，加入稀釋好的DCFH-DA，37℃培養箱中孵育20 min；無血清的培養液洗滌，去除多余的DCFH-DA；PBS 洗滌，以1 500 r/min 離心5 min，棄上清液；300 μL PBS 重懸細胞，上機，檢測細胞ROS 水平。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位 根據JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒說明書，配置JC-1 工作液；收集細胞，加入500 μL JC-1 工作液懸浮細胞，培養箱孵育15～20 min；以2 000 r/min 離心5 min，收集細胞，1×Incubation Buffer 洗滌2 次；500 μL 1×Incubation Buffer 懸浮細胞，上機。

1.3.3 ELISA 法檢測細胞內SOD 活性和微量MDA含量 根據試劑盒說明書配置好相關工作液，設置空白孔、標準孔和樣品孔。標準孔依次加入0.0 u/mL、12.5 u/mL、25.0 u/mL、50.0 u/mL、100.0 u/mL 和200.0 u/mL 濃度的50 μL 標準品，樣品孔中加入50 μL 樣品混勻，加入100 μL 酶標試劑。封板膜封板，37℃孵育60 min；揭封板膜，洗滌液洗滌，棄去液體，拍干；先后加入顯色劑A、B 各50 μL，混勻，37℃，避光顯色15 min；加入50 μL 終止液；450 nm波長測定各孔吸光度值。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測Cyp1a1、Chrnb4 mRNA 相對表達量 提取各組待測細胞內RNA，隨后根據對應的逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，加入反應體系，在PCR 儀上檢測。根據2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物由通用生物系統（安徽）有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western blotting 檢測蛋白表達水平 將各組細胞加入裂解液，充分研磨，以12 000 r/min 離心15 min，收集勻漿。取上清液，根據BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度。配置好濃縮膠和分離膠，加入已變性的蛋白樣品，電泳，轉膜。加入一抗，4℃過夜；加入二抗，室溫孵育1～2 h。滴加ECL曝光液曝光。用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集待測細胞，PBS 洗滌2 次，以1 500 r/min 離心3 min；加入預冷的1×Binding Buffer 300 μL，重懸細胞；分別向每管細胞中加入3 μL Annexin V-APC 和5 μL 7-AAD，混勻；室溫避光孵育10 min；加入預冷的1×Binding Buffer 200 μL，混勻，上機檢測。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組SOD、MDA、ROS、線粒體膜電位比較

對照組、尼古丁組、高糖/高脂模型組與尼古丁+高糖/高脂模型組SOD 水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），尼古丁組、高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖/高脂模型組較對照組降低（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較高糖/高脂模型組降低（P<0.05）。各組MDA 水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較對照組和高糖/高脂模型組升高（P<0.05）。各組ROS 含量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖/高脂模型組較對照組升高（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較高糖/高脂模型組升高（P<0.05）。各組線粒體膜電位的比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），尼古丁組、高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖/高脂模型組較對照組降低（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較高糖/高脂模型組降低（P<0.05）。見表1 和圖1、2。

表1 各組SOD、MDA、ROS、線粒體膜電位水平比較（）

表1 各組SOD、MDA、ROS、線粒體膜電位水平比較（）

圖1 各組ROS含量比較圖

圖2 各組H9C2細胞流式細胞圖

2.2 尼古丁對高糖/高脂H9C2 細胞內Cyp1a1、Chrnb4 mRNA、蛋白及p-AMPK、Caspase-2凋亡途徑相關蛋白表達水平的影響

對照組、尼古丁組、高糖/高脂模型組與尼古丁+高糖/高脂模型組Cyp1a1 和Chrnb4 mRNA 表達比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），尼古丁組、高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖/高脂模型組較對照組升高（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較高糖/高脂模型組升高（P<0.05）。各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1、Chrnb4 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），尼古丁組和尼古丁+高糖/高脂模型組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyp1a1、Chrnb4 蛋白相對表達量較對照組升高（P<0.05），p-AMPK 蛋白相對表達量較對照組降低（P<0.05），高糖/高脂模型組p-AMPK 蛋白相對表達量較對照組降低（P<0.05），Caspase-9、Cyp1a1、Chrnb4 蛋白相對表達量較對照組升高（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyp1a1、Chrnb4 蛋白相對表達量較高糖/高脂模型組升高（P<0.05），p-AMPK 蛋白相對表達量較高糖/高脂模型組降低（P<0.05）。見表2、3 和圖3。

圖3 各組蛋白相對表達量

表2 各組Cyp1a1、Chrnb4 mRNA相對表達量比較（）

表2 各組Cyp1a1、Chrnb4 mRNA相對表達量比較（）

2.3 各組H9C2 細胞凋亡率和Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1 蛋白相對表達量比較

shRNA-NC 組、shRNA-Cyp1a1 組、AMPK 抑制劑組與shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組H9C2 細胞凋亡率分別為（15.90±1.77）%、（2.38±0.74）%、（35.90±4.16）%、（27.97±2.30）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=97.790，P=0.000），shRNA-Cyp1a1 組較shRNA-NC 組降低（P<0.05），AMPK 抑制劑組和shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組較shRNA-NC 組升高（P<0.05），shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組較AMPK抑制劑組降低（P<0.05）。各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK 和Cyp1a1 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），shRNA-Cyp1a1 組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyp1a1 蛋白水平較shRNA-NC 組降低（P<0.05），p-AMPK 蛋白水平較shRNA-NC 組升高（P<0.05），AMPK 抑制劑組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyp1a1 蛋白水平較shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組升高（P<0.05），p-AMPK 蛋白水平較shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組降低（P<0.05），shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組Cyp1a1 蛋白水平與shRNA-Cyp1a1 組比較無差異（P>0.05）。見表4 和圖4、5。

圖4 各組H9C2細胞流式細胞術結果

表3 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1、Chrnb4蛋白相對表達量比較（）

表3 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1、Chrnb4蛋白相對表達量比較（）

表4 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1蛋白相對表達量比較（）

表4 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1蛋白相對表達量比較（）

2.4 Chrnb4 對心肌細胞凋亡及Caspase-2 凋亡途徑的影響

shRNA-NC 組、shRNA-Chrnb4 組、AMPK 抑 制劑組和shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組心肌細胞凋亡率分別為（15.01±2.46）%、（1.89±0.58）%、（37.12±2.85）%、（28.24±3.13）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=117.200，P=0.000），shRNA-Chrnb4 組 較 shRNA-NC 組降低（P<0.05），AMPK 抑制劑組和shRNA-Chrnb4+AMPK抑制劑組較對照組增加（P<0.05），shRNAChrnb4+AMPK 抑制劑組較AMPK 抑制劑組降低（P<0.05）。各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK 和Chrnb4 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），shRNAChrnb4 組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Chrnb4蛋白相對表達量較shRNA-NC 組降低（P<0.05），p-AMPK 蛋白相對表達量較shRNA-NC 組升高（P<0.05），AMPK 抑制劑組和shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9 相對表達量較shRNA-NC 組升高，p-AMPK 蛋白相對表達量較shRNA-NC 組降低（P<0.05），shRNAChrnb4+AMPK 抑制劑組Chrnb4 蛋白較shRNA-NC組降低，shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Chrnb4 蛋白相對表達量較AMPK 抑制劑組降低（P<0.05），p-AMPK 蛋白相對表達量較AMPK 抑制劑組升高（P<0.05）。shRNAChrnb4+AMPK 抑制劑組Chrnb4 蛋白相對表達量與shRNA-Chrnb4 組比較無差異（P>0.05）。見表5 和圖6、7。

圖5 各組蛋白相對表達量

表5 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Chrnb4蛋白相對表達量比較（）

表5 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Chrnb4蛋白相對表達量比較（）

圖6 各組H9C2細胞流式細胞術結果

圖7 各組蛋白相對表達量

3 討論

心肌細胞凋亡是DCM 發展機制之一。有研究表明，低凋亡水平心肌細胞可導致致命的擴張型心肌病，抑制心肌細胞凋亡可阻礙該疾病的進展[9]。因此抑制心肌細胞凋亡可能是預防DCM 的新療法。本研究結果發現，尼古丁誘導且加重高糖高脂心肌細胞凋亡，其機制可能是通過上調Cyp1a1、Chrnb4 表達，抑制AMPK 活性，導致線粒體功能障礙，氧化應激增加，進一步激活Caspase-2 凋亡途徑。

ROS 是在心臟生理和病理中具有重要作用的信號分子[10]。在生理條件下，心臟ROS 信號調節心臟發育和心肌細胞成熟、心臟鈣處理、興奮收縮耦合和血管張力；然而，導致ROS 水平升高時產生不受調節的病理狀況可通過對DNA、蛋白質和脂質的氧化損傷以及線粒體通透性轉換孔的激活、線粒體功能障礙等導致氧化應激[11]。氧化應激與各種細胞類型的凋亡信號有關，包括心肌細胞[12-13]。本研究中發現尼古丁及高糖/高脂均會導致心肌細胞線粒體功能障礙，氧化應激增加，而尼古丁會放大高糖/高脂培養條件下的心肌細胞的線粒體功能障礙和氧化應激效應，與ZHANG 等[14]和RAMALINGAM等[15]的研究結果一致。

AMPK 是一種主要的細胞能量傳感器和代謝穩態的主調節器，在調節心肌細胞凋亡中發揮著重要作用[16]。AMPK 與尼古丁的一些作用直接相關[17]。有研究證明敲除Cyp1a1 可抑制細胞增殖，阻斷與Cyclin D1 減少相關的Go-G 細胞周期，并增加與AMPK 和Akt 磷酸化減少相關的凋亡[18]，與本研究結果一致。這些結果表明Cyp1a1 參與細胞增殖和存活途徑，其機制可能與AMPK 通路有關。編碼nAChRβ4 亞基的Chrnb4基因廣泛存在于氣道上皮細胞，并形成異質nAchR 來調節尼古丁受體的親和力。有研究證明激動劑1,1-二甲基-4-苯基哌嗪碘化選擇性靶向α3β4 nAChr，通過增加棕色脂肪、心臟和骨骼肌中的葡萄糖攝取，顯著改善了糖耐量[19]。本研究結果發現，Chrnb4 表達與AMPK 活性呈負相關，即干擾Chrnb4 后AMPK 活性上調。故筆者推測，尼古丁上調Cyp1a1、Chrnb4 表達，抑制AMPK 活性，進而導致線粒體功能障礙，氧化應激增加，最終導致心肌細胞凋亡。

本研究結果進一步發現，H9C2 細胞內Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平顯著增加，干擾Cyp1a1 或Chrnb4 后，H9C2 細胞內Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9 蛋白相對表達量顯著下調。越來越多的證據表明，具有半胱氨酸酶招募結構域的凋亡抑制因子是一種內源性蛋白，在心臟組織中高度表達，能夠通過靶向多點激活來抑制缺血-再灌注誘導的心肌細胞凋亡[20]。SINHA-HIKIM 等[21]的研究結果顯示，Caspase-2 介導的內在通路信號是尼古丁加高脂肪飲食誘導心肌細胞凋亡的機制之一。

綜上所述，尼古丁誘導高糖、高脂心肌細胞凋亡率增加，其機制可能是上調Cyp1a1、Chrnb4 表達，抑制AMPK 活性，導致線粒體功能障礙，氧化應激增加，并進一步激活Caspase-2 凋亡途徑，上調Caspase-3、Caspase-9 表達誘導細胞凋亡。