Akk菌在消化道疾病中的研究進展*

趙佳琳，董衛國

（武漢大學人民醫院 消化內科,湖北 武漢 430060）

近些年來，腸道菌群在宿主疾病轉歸過程中扮演了何種角色一直是醫學界的研究焦點，且相關的益生菌產品被投入臨床使用后獲得了較多的正面反饋，因此，陸續有科學家提出下一代益生菌（nextgeneration probiotics,NPGs）的概念。相較于第一代益生菌（主要是乳酸桿菌和雙歧桿菌），NPGs 符合美國食品藥品監督管理局對活生物治療產品的定義：①含有活生物體，如細菌；②適用于人類疾病或病癥的預防、治療或治愈；③不是疫苗[1]。Akk 菌作為NGPs 中的明星菌株，因其減輕體重和改善糖脂代謝的作用而受到廣泛關注[2]，與此同時，Akk 的活體菌株、巴氏消毒株（PAm）、外膜蛋白Amuc_1100、胞外囊泡（AmEV）等主要衍生物被應用于基礎及臨床試驗中，以探尋該菌的不同活性和組分在各個系統疾病中的作用機制。眾多因果性研究證明Akk 菌參與了2 型糖尿病、阿爾茲海默病、衰老等病理、生理過程[3]。而本文專注于闡述Akk 菌在炎癥性腸病（inflammatory bowel disease,IBD）、結直腸癌（colorectal cancer,CRC）、肝病等消化系統疾病中的最新研究進展，并討論該菌在臨床上作為生物制劑在腸道和肝臟疾病的應用前景。

1 Akk菌及其主要衍生物的生化特征

2004 年有研究者從1 例健康成年志愿者的糞便中分離出了一種在黏蛋白降解細菌里占據優勢地位的MucT 菌株，并將其命名為Akk 菌，該菌是一種革蘭陰性、厭氧的細菌，在37℃和pH 值為6 的環境中能達到最快生長速率[4]。其在患者嬰兒時期就定植于腸道黏液層并進行大量繁殖，且豐度在1 年內就能發展到接近成年人的水平，占腸道微生物群的1%～3%，而在老年人中有所下降[5]。

黏液層中豐富的黏蛋白是Akk 菌賴以存活的碳源和氮源，其由富含絲氨酸和蘇氨酸殘基的肽核組成，而該肽核則通過糖苷鍵連接的寡糖修飾，并由唾液酸或硫酸基終止[4]。在適宜的生長條件下，Akk菌能上調多種糖苷水解酶的基因表達水平，其中以氨基糖、核苷酸糖、半乳糖水解酶最具代表性。此外，與能量代謝息息相關的腺苷三磷酸調節蛋白也在該菌的生長和分裂增殖過程中起到了至關重要的作用[6]。

值得注意的是，人類腸道中的Akk 菌存在亞種水平的遺傳分層，換句話說，不同的菌株之間具有明顯的基因型和表型差異。通過這些差異可將Akk菌大致分為4 個系統群，其在耐氧性、上皮細胞黏附力、細菌聚集度、短鏈脂肪酸產出率等方面各有不同的優勢，而這些表型會極大地影響細菌在腸道的定植以及對宿主的功能調節[7]。

將Akk 菌在70℃下加熱30 min 得到的PAm 較活菌有更強的改善糖脂代謝的能力，而這歸功于其外膜中的熱穩定蛋白Amuc_1100，其能通過與腸上皮細胞表面的Toll 樣受體2（toll-like receptors 2,TLR2）結合來發揮生物學活性[8]。Amuc_1100 由Ⅳ型纖毛基因簇編碼，并通過N 端跨膜結構域固定在菌株的外膜上，參與構成了Akk 菌的纖毛。其在體外擁有可變的低聚體形態，且二聚體對TLR2 有最高的親和力，但其在體內的組裝形式有待進一步研究[9]。

脫離Akk 菌體的AmEV 作為黏膜遞送載體，在掃描電子顯微鏡下呈直徑為40～50 nm 的球形，可實現細菌對腸道以外組織的功能調控[10]。

2 Akk菌在IBD中的保護性作用及機制

在克羅恩病和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）患者的腸上皮中，Akk 菌的豐度較健康人相比減少[11]。而與靜態UC 患者相比，活動性UC 患者體內的Akk 菌定植率更低，證實了該菌的含量與結腸活動性炎癥呈負相關[12]。體內實驗表明，用Akk 菌灌胃IBD小鼠數周后，小鼠的體重下降、結腸縮短等表現以及較高的組織病理學評分能夠得到逆轉，受損的腸道屏障和失調的菌群也得到部分恢復，且血清和組織中的抗炎細胞因子水平將會上升，而促炎細胞因子水平則會下降[13]，相關研究證明口服AmEV 也能夠發揮同樣的保護性作用[14]。

深層次的機制探究實驗揭示了Akk 菌降低腸道通透性和抑制結腸炎癥的多種調控途徑。首先是緊密連接蛋白的表達，Akk 菌外膜中的Amuc_1100與IECs 表面的TLR2 結合后會激活下游的AMPK 通路，最終增加胞膜中發揮骨架連接作用的Zo-1 蛋白，并同時抑制孔隙生成蛋白Claudin2的基因表達，這種雙重調控作用極大地維護了腸道屏障的完整度[15]。其次是IECs 的壽命與數量，Akk 活菌能夠下調鈣信號通路上關鍵基因的表達，以此來緩解鈣離子濃度升高誘導的細胞自噬與凋亡。而失活的Akk菌可以改變炎癥IECs 的細胞周期，延長生存時間[16]。更重要的是，Akk 菌在代謝過程中生產的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸，作用于IECs 上的G 蛋白偶聯受體后能加速腸道干細胞增殖以及向分泌譜系細胞分化，這種作用機制不僅能加速腸上皮的更新，還能增加黏液層的厚度[17]。

除此之外，炎癥相關細胞因子的表達也會受到此菌的影響。Akk 菌識別并激活腸細胞的TLR2 后會抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活化，眾所周知，NF-κB 信號通路的激活將導致異常的炎癥反應，而Akk 菌對此途徑的調控能降低腫瘤壞死因子α、白細胞介素1 等致炎因子的表達，并且轉化生長因子β 以及白細胞介素10 等抗炎物質的濃度也會有所增加[15]。上述抑制炎癥的過程離不開腸道細胞表面TLR2 的識別與激活，但Akk 活菌、PAm 和Amuc_1100還能夠通過參與色氨酸（Tryptophan,Trp）的代謝來減輕結腸炎癥，并且不依賴結腸組織。UC 患者的腸道有過度的Trp 代謝激活，而Akk 菌能在腸細胞參與Trp 代謝的基因表達水平不變的情況下，抑制主要的犬尿氨酸途徑，恢復芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor,AhR）的多種配體水平，且AhR靶基因如白細胞介素10 的表達也會上調，這表明Akk 菌可通過調節Trp 的代謝從而激活AhR 信號通路，達到減輕結腸炎癥的效果[18]。

3 Akk菌在CRC中的保護性作用及機制

對CRC 患者的腸道黏膜組織樣本進行微生物種類及含量測定發現，Akk 菌的豐度與比例較健康人群高出許多[19]，且接受奧沙利鉑、氟尿嘧啶、亞葉酸鈣聯合化療后的患者會有明顯的腸道菌落組成改變，其中Akk 菌的大量增殖與藥物的抗癌效果呈正相關[20]。免疫療法是當代醫學在抗腫瘤領域的突破性成果，Akk 菌聯合白細胞介素2 對腸癌細胞的抑制效果較單獨使用白細胞介素2 顯著增強[21]。由此可見，Akk 菌有潛力成為檢出CRC 的細菌生物標志，并有可能成為增加抗癌藥物療效的臨床策略。

從機制上來說，Akk 菌對免疫系統的調節能力和直接的殺細胞作用均有助于腫瘤細胞凋亡。巨噬細胞是腫瘤微環境的重要組成部分，Akk 菌結合其表面的TLR2 后能夠誘導NF-κB 激活，并加速炎癥小體NLRP3 的生成，而此物質是把控巨噬細胞向抗腫瘤的M1 表型極化的關鍵因素[22]。另外，腸道中的CD8 細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）的數量也可受到Akk 菌的調控，尤其是在結腸炎相關結腸癌的免疫應答階段。口服PAm 或Amuc_1100 能夠減少小鼠結腸腫瘤的數量與面積，延緩疾病的進展，這種臨床緩解依賴于Akk 菌對腫瘤周圍及腸系膜淋巴結中的CTL 的募集，且被激活CTL 將會表達較高濃度的腫瘤壞死因子α 來抑制腫瘤，但幾乎不表達介導免疫逃逸的程序性死亡受體1[23]。值得一提的是，向患前列腺癌的小鼠靜脈注射AmEV 也能夠提高腫瘤組織中CD8 T 淋巴細胞和M1樣巨噬細胞的濃度，并能使淋巴細胞表達顆粒酶B和干擾素γ，從而起到抑制癌細胞增殖和侵襲的作用，且有效劑量的AmEV 不會對健康組織產生毒害，還可使正常細胞耐受[24]。AmEV 對CRC 細胞是否具有殺傷力，以及向CRC 小鼠模型注射AmEV 的安全性或許能成為研究Akk 菌的新方向之一。

除了調控免疫細胞，Akk 菌還能通過分泌一種名為Amuc_1434 的天冬氨酸蛋白酶來實現黏液性CRC細胞的自噬與凋亡。Amuc_1434 不僅能誘導腫瘤細胞中活性氧的產生，利用氧化應激引導胞內線粒體功能障礙，還能上調死亡受體及腫瘤壞死因子相關的細胞凋亡誘導配體，通過內源性線粒體通路和外源性死亡受體通路這兩條關鍵途徑激活腫瘤細胞凋亡[25]。更有意義的是，黏液性CRC 組織的侵襲與擴散也會受到Amuc_1434 的抑制，而黏蛋白2 是該酶的主要作用對象。黏蛋白在此類型CRC 中高度表達，與腫瘤增殖、擴散及免疫逃逸密切相關。因此，Amuc_1434 對Muc2 的降解有助于延緩癌癥的進展[26]。

4 Akk菌在肝病中的保護性作用及機制

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）因其在全球范圍內的高患病率已成為慢性肝病的主要負擔，其特征在于機體代謝紊亂促發并推動了肝細胞脂肪樣變性及功能障礙，進而誘導肝臟的炎癥反應與纖維化，并最終導致肝硬化和/或惡變[27]，而Akk菌被證實與這一進行性病程密切相關。

在NAFLD 的早期，腸道Akk 菌的高豐度代表了人體更為健康的代謝狀態，突出表現在空腹血糖、血漿甘油三酯、體脂分布這3 個指標上[28]；而在NAFLD的中晚期，可觀察到糞便和結腸中Akk 菌種的耗竭，且這種現象特異性地與非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）的氧化損傷標志物和纖維化指數呈正相關[29]。通過上述結論可以推斷，Akk 菌有極大的潛力成為預測NAFLD 患病風險的特定微生物指標，以及疾病進展期的無創診斷和預后工具。因為目前尚無有效的治療方法，因此NASH 的早期診斷有助于預防不良結局，而相較于創傷性和偏倚較大的肝活檢穿刺術，無創的新型生物標志物如Akk 菌則能夠提供更安全、更準確的替代方案。

不僅如此，在補充Akk 活菌、PAm 或AmEV 后，NASH 相關的血清炎性介質、脂質譜、轉氨酶等參數得以逆轉至正常水平，肝實質的損害程度和肝臟炎癥細胞浸潤狀態也可得到有效改善，且分泌胞外基質參與纖維瘢痕形成的活化肝星狀細胞（hepatic stellate cells,HSC）能夠消退至靜止狀態[30]。此外，在其他類型的肝損傷，如酒精性和藥物性肝炎模型中，同樣能得到Akk 菌豐度與肝功能障礙之間呈負相關的結論，且在恢復該菌的腸道定植率后，可觀察到肝臟壞死灶范圍和炎癥水平的降低[31-32]。以上實驗數據證明，Akk 菌有潛能成為挽救肝細胞損害、抑制肝臟間質膠原生成、改善肝功能的益生菌制劑。

腸肝軸是腸道微生物與肝臟進行雙向信號交流的重要途徑，也是Akk 菌干預肝炎的主要手段。當腸道屏障遭受各種因素侵襲時，Akk 菌能增加緊密連接蛋白和黏蛋白的基因表達，并重塑失調的微生物群，以此來加固腸肝軸的第一道防線，避免細菌和內毒素通過門靜脈易位至肝臟后被TLR4 識別并觸發炎癥[32]。除此之外，Akk 菌還能激活腸道中的L-天冬氨酸轉運蛋白來保持門靜脈內該氨基酸的水平，而高濃度的L-天冬氨酸可有效促進腸肝軸上的脂質氧化及膽汁酸代謝，并抑制活性氧的生成，從而達到減少肝臟脂肪沉積和肝細胞氧化凋亡的效果[33]。至關重要的是，當導致肝損傷的病理因素持續存在時，長期的病原體和炎癥刺激會讓原本靜止的HSC 分化為肌成纖維細胞，并分泌纖維蛋白將再生肝細胞分隔，成為違背肝臟原生結構的假小葉雛形。而相較于Akk 活菌與PAm，AmEV 能顯著抑制活化HSC 的TLR5 和TLR9 的基因轉錄，同時上調抗炎因子ppar-α 和ppar-β 的基因表達，最終使HSC 恢復至靜止狀態，避免接下來的肝臟纖維化，且這種作用具有劑量依賴性[34]。由此可推測，Akk 菌能夠通過囊泡的分泌，由腸肝軸介導實現肝臟早期纖維化的逆轉，即使目前尚未知其對已形成的纖維瘢痕有何功效，但抑制HSC 激活的重要功能足以使Akk 菌成為預防肝硬化的備選益生菌。

Akk 菌全身性的調節代謝作用對于預防非酒精性脂肪肝、延緩進展為NASH 較局部的腸肝軸更有意義。Akk 菌的細胞裂解物通過增加絲氨酸蛋白酶抑制劑A3 同系物SERPINA3G 的濃度，可抑制下游ppar-γ、脂聯素等參與脂肪細胞分化和脂質積累的基因表達，并能調節細胞的能量代謝，最終達到減少脂肪組織內脂肪細胞大小以及胞內甘油三酯沉積的目的[35]。除了已知的Amuc 系列，新發現的P9 也是Akk菌分泌的一種蛋白，與胞間黏附分子2 結合后，可誘導體內胰高血糖素樣肽-1 的分泌以及棕色脂肪組織中解偶聯蛋白的表達，這種作用機制能夠有效促進胰島素的水平和脂肪組織分解產熱，從而產生維持血糖平穩和調節脂肪含量的促代謝效果[36]。

5 總結

Akk 菌及其衍生物通過改善宿主腸道屏障功能、調控免疫系統應答、參與腸肝軸信號傳導、促進新陳代謝水平等作用機制，在緩解結腸炎癥、抑制結直腸腫瘤、減輕肝臟損傷等方面展現出卓越的能力，且歐洲食品安全局就PAm 作為新型食品發表的意見中明確指出，當食物中的活細胞數量<10 CFU/g時，目標群體攝入PAm≤3.4×1010個/d 是安全的[37]。雖然一些研究結果表明，目前人類對Akk 菌在疾病中的具體作用和機制的認識尚存在一定的局限性，其作為益生菌制劑應用于疾病的臨床診療還需要更多的實驗去探究驗證，但其診斷、預防和治療上述消化道疾病的潛能使之成為NPGs 中的佼佼者。