食管癌根治術患者血清microRNA-27a、microRNA-203a-3p表達及與預后的關系*

楊金華，趙天增，張嶺

（南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院 普胸外科，河南 南陽 473058）

食管癌是常見的消化系統惡性腫瘤，全球每年新發60.4 萬例，死亡54.4 萬例[1]。食管癌的病理類型包括鱗癌、腺癌等，其中食管鱗癌是最主要的病理類型，占所有類型的90%以上。目前根治性切除為食管癌的治愈性治療手段，但部分患者治療后仍會發生腫瘤復發及轉移，導致患者死亡[2]。因此，尋找能夠預測食管癌患者根治術后預后的腫瘤標志物具有重要臨床價值。microRNA（miRNA）是單鏈非編碼RNA，能夠通過結合靶基因mRNA，調控下游基因的表達，與人類感染、炎癥及腫瘤等多種疾病的發生、發展密切相關[3]。microRNA-27a（miR-27a）編碼基因位于19p13.12。近年來研究發現，miR-27a 在Wilms瘤[4]、非小細胞肺癌[5]等惡性腫瘤組織中的表達異常上調或下調，其通過影響下游癌基因，如前列腺、乳腺過表達因子1 的表達，促進腫瘤增殖、遷移及侵襲等，導致腫瘤惡性進展。microRNA-203a-3p（miR-203a-3p）編碼基因位于14q32.33。近年來研究發現，miR-203a-3p 能夠調控轉錄因子Slug 的表達，促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，參與促進乳腺癌[6]，胰腺癌[7]等惡性腫瘤的侵襲及轉移，導致患者預后不良。目前食管癌患者術前血清miR-27a、miR-203a-3p 表達及與術后預后的關系報道較少。基于此，本研究通過檢測食管癌根治性切除術患者術前血清miR-27a、miR-203a-3p 的表達，探討其對預后的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年3 月—2017 年3 月南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院行食管癌根治術治療的123 例食管癌患者作為研究組。納入標準：①接受食管癌根治術，術后經病理組織學檢查診斷為食管鱗癌；②初次診治，既往無放化療史；③臨床資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并嚴重心肺功能障礙；③合并精神障礙性疾病或妊娠哺乳期婦女。其中，男性85例，女性38例；年齡41～66歲，平均（55.39±6.27）歲；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期69 例，Ⅲ期54 例；腫瘤分化程度：高中分化75 例，低分化48 例；腫瘤位置：上胸段29 例，中胸段55 例，下胸段39 例；有淋巴結轉移42 例，無淋巴結81 例。另取同期本院健康體檢人群64 例作為對照組。其中，男性50 例，女性14 例；年齡43～64 歲，平均（54.26±5.98）歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準通過，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

ABI7500 型實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）儀（美國ABI 公司），TRIzol 試劑盒（美國賽默飛公司），逆轉錄試劑盒（M-MLV）、qRT-PCR 試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.3 qRT-PCR 檢測血清miR-27a、miR-203a-3p的表達

留取研究組入院次日和對照組查體時空腹靜脈血約5 mL，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清，置入-80℃冰箱冷凍保存。采用TRIzol 試劑盒提取血清總RNA，逆轉錄為cDNA，進行qRT-PCR 反應。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共計40個循環。總反應體系10 μL：cDNA 1μL，正反向引物各1 μL，SYBR green Master Mix 5 μL，ddH2O 2 μL。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。miR-27a 正向引物：5'-AT GGTTCGTGGGTTCACA-3'，反向引物：5'-GTGGCTA AGTTCCGACG-3'，長度分別為18 bp 和17 bp；miR-203a-3p 正向引物：5'-ATCATCCCTGCATCCACT-3'，反向引物：5'-ATCCACGACGGACACATT-3'，長度均為18 bp。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算血清miR-27a、miR-203a-3p 相對表達量。

1.4 隨訪

所有患者連續隨訪5 年，第1 年每3 個月隨訪1 次，第2 年每半年隨訪1 次，第3～5 年每年隨訪1 次。以門診或電話方式隨訪，截止日期為2022 年4 月1 日。隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結束。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用t檢驗或方差分析；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗；影響因素的分析用單因素或多因素Cox 回歸模型；P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-27a、miR-203a-3p 相對表達量比較

研究組血清miR-27a、miR-203a-3p 相對表達量分別為（3.09±0.45）、（2.79±0.37），對照組分別為（0.88±0.16）、（0.78±0.24）。兩組血清miR-27a、miR-203a-3p 相對表達量比較，差異有統計學意義（t=38.017 和39.339，均P=0.000），研究組高于對照組。

2.2 不同臨床病理特征食管癌患者根治術前血清miR-27a、miR-203a-3p相對表達量比較

不同腫瘤分期、分化程度和是否淋巴結轉移食管癌患者根治術前血清miR-27a、miR-203a-3p 相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05），腫瘤分期Ⅲ期、分化程度低分化、有淋巴結轉移食管癌患者根治術前血清miR-27a、miR-203a-3p 相對表達量高于腫瘤分期Ⅰ、Ⅱ期、分化程度高中分化、無淋巴結轉移患者。不同年齡、性別及腫瘤位置食管癌患者根治術前血清miR-27a、miR-203a-3p 相對表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征食管癌患者根治術前血清miR-27a、miR-203a-3p相對表達量比較

2.3 食管癌患者術前不同血清miR-27a、miR-203a-3p表達與預后的關系

123 例患者隨訪過程中死亡80 例，以血清miR-27a 相對表達量平均值3.09 為界，分為miR-27a 高表達組（miR-27a ≥ 3.09）和miR-27a 低表達組（miR-27a <3.09），分別有62 例和61 例。miR-27a 高表達組患者5 年總生存率為16.13%（10/62），miR-27a 低表達組為54.10%（33/61），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=19.496，P=0.000），miR-27a 高表達組低于miR-27a 低表達組。以血清miR-203a-3p 相對表達量平均值2.79 為界，分為miR-203a-3p 高表達組（miR-203a-3p ≥ 2.79）和miR-203a-3p 低表達組（miR-203a-3p <2.79），分別有60 例和63 例。miR-203a-3p 高表達組患者5 年總生存率為18.33%（11/60），miR-203a-3p 低表達組為50.79%（32/63），差異有統計學意義（χ2=14.241，P=0.000），miR-203a-3p高表達組低于miR-203a-3p 低表達組。見圖1。

圖1 食管癌患者術前不同血清miR-27a、miR-203a-3p表達與預后的生存曲線

2.4 影響食管癌患者預后的Cox回歸分析

以年齡（<60 歲=0，≥ 60 歲=1）、性別（女=0，男=1）、腫瘤位置（下胸段=0，上、中胸段=1）、分化程度（高、中分化=0，低分化=1）、淋巴結轉移（無=0，有=1）、腫瘤分期（Ⅰ、Ⅱ期=0，Ⅲ期=1）、miR-27a（<3.09=0，≥ 3.09=1）、miR-203a-3p（<2.79=0，≥ 2.79=1）為自變量（引入水準為0.05，剔除水準為0.10），以是否死亡為因變量（否=0，是=1）。進行單因素Cox 回歸分析。結果顯示：腫瘤分期[=1.730（95% CI：1.434，2.099）]、淋巴結轉移[=1.602（95% CI：1.191，2.153）]、miR-27a [=2.041（95% CI：1.813，2.463）]、miR-203a-3p [=2.060（95% CI：1.921，2.279）]是食管癌患者預后的影響因素（P<0.05）。見表2。

表2 影響食管癌患者預后的單因素Cox回歸分析參數

3 討論

我國每年新發食管癌約24 萬例，達全球發病例數的50%以上[8]。食管癌早期癥狀不明顯，當出現吞咽困難等臨床表現時已處于中晚期，即使行積極根治性手術等治療后，術后復發率和病死率仍較高[9]。目前臨床上主要依據腫瘤分期、淋巴結轉移等臨床病理學指標評估食管癌患者的臨床預后，但由于腫瘤異質性，不同患者預后仍然存在一定差異[10]。因此，尋找評估食管癌預后的腫瘤標志物，對患者的個體化治療，具有重要臨床意義。

miRNA 是長度為20～24 個核苷酸的非編碼RNA，成熟的miRNA 被整合到RNA 誘導的沉默復合物中，通過不完全堿基配對來識別靶基因mRNA，抑制靶基因mRNA 的翻譯，參與真核生物基因表達的轉錄后調控。miR-27a 是近年來發現的新miRNA，其通過調控機體代謝，免疫等功能，與心力衰竭[11]、糖尿病[12]等疾病關系密切。本研究中食管癌患者血清miR-27a 表達明顯升高，提示miR-27a 參與食管癌的腫瘤發生。有研究表明，長鏈非編碼RNA TUG1 能夠作為分子海綿與miR-27a 相互作用，抑制miR-27a 的表達，腫瘤發生時TUG1 表達下調，導致miR-27a 表達升高，促進下游腫瘤壞死因子-α 的表達，促進腫瘤發生[13]。此外，腫瘤發生過程中由于細胞過度增殖，處于缺氧狀態，缺氧能夠誘導腫瘤細胞缺氧誘導因子1α 的表達，促進miR-27a 的表達[14]。本研究中，血清miR-27a 表達與腫瘤分期、分化程度及淋巴結轉移有關，表明miR-27a 參與促進食管癌進展。有研究表明，miR-27a 可以靶向并負調節膜相關鳥苷酸激酶2，上調磷脂酰肌醇2 激酶/Akt 信號通路，促進程序性死亡配體1 的表達，促進免疫逃避，導致腫瘤進展[15]。本研究中，血清miR-27a 高表達患者生存預后較差，是影響食管癌患者生存預后的獨立因素。提示血清miR-27a 可能作為新的腫瘤標志物，有助于判斷患者的臨床預后。有研究發現，腫瘤組織miR-27a 表達上調能夠增強mTOR 信號傳導，促進腫瘤細胞糖酵解，導致腫瘤細胞化療耐藥性形成，導致患者不良預后[16]。

miR-203a-3p基因位于14 號染色體，具有1 個外顯子，其可通過調控下游靶基因，如細胞內信號轉導分子1 的表達，參與細胞增殖、分化等過程的調節[17]。本研究中，食管癌患者血清miR-203a-3p 表達明顯上調，提示miR-203a-3p 參與食管癌的腫瘤發生。分析其原因可能與環狀RNA 的表達調控有關。有研究發現，環狀RNA 43280 作為腫瘤抑制因子，能夠作為內源競爭性RNA，抑制miR-203a-3p 的表達，腫瘤發生時環狀RNA 43280 表達下調，導致miR-203a-3p 表達升高，孕激素和脂聯素分子受體3 過度激活，促進腫瘤增殖[18]。本研究中，血清miR-203a-3p 的表達與腫瘤分期、分化程度及淋巴結轉移有關，表明miR-203a-3p 參與促進食管癌的惡性進展。既往研究發現，食管癌腫瘤細胞ECA109 中miR-203a-3p 表達顯著升高，并能夠負調控C 末端結合蛋白2 的表達，促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，上皮性標志E-鈣黏素表達升高，間質性標志波形蛋白表達升高，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[19]。本研究中，血清miR-203a-3p 高表達是患者不良預后的獨立因素。既往研究表明，miR-203a-3p 表達升高通過促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，增強腫瘤細胞對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性，miR-203a-3p 高表達患者靶向治療的無進展生存期明顯縮短[20]。

綜上所述，食管癌患者根治術前血清miR-27a、miR-203a-3p 表達升高，兩者表達與腫瘤分期、分化程度及淋巴結轉移有關，是影響食管癌患者生存預后的獨立因素，將來有希望成為評估食管癌患者術后預后的腫瘤標志物。但本研究尚存在一定的不足之處，由于樣本量有限，未能對食管癌患者進行分層分析，并且兩者食管癌中具體作用機制尚不清楚，需今后進行深入研究。