補(bǔ)腎活血方對(duì)抗磷脂抗體陽(yáng)性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血microRNA-423-5p表達(dá)的影響及療效分析*

韓永梅，呂宣宣

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450003；2.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 開(kāi)封 475099）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion,RSA）是常見(jiàn)妊娠疾病之一，表現(xiàn)為連續(xù)的早期妊娠流產(chǎn)，主要指妊娠20 周前連續(xù)≥ 2 次流產(chǎn)，發(fā)病率為2%～5%[1-2]。RSA 具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，抗磷脂抗體陽(yáng)性是目前已知的與RSA 有關(guān)的免疫因素，能夠影響機(jī)體凝血狀態(tài)、血栓形成，造成胎兒缺氧死亡，導(dǎo)致RSA[3]。西醫(yī)針對(duì)抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 的治療多集中于抗血栓形成、免疫抑制等方面，臨床多阿司匹林、地屈孕酮等藥物進(jìn)行治療，但其治療抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 效果有限，仍存在成功分娩率低等問(wèn)題[4]。目前對(duì)于抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 的治療尚未有明確證據(jù)表明何種治療方案較佳，探討治療抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 的高效治療方案迫在眉睫。

中醫(yī)將抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 歸屬于“滑胎”“數(shù)墮胎”等范疇，認(rèn)為腎藏精、主生殖、生之本，腎虛為抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者滑胎病機(jī)之根本，腎虛沖任不守可致瘀，瘀血阻礙胞絡(luò)，腎陰精血乏，加劇腎虛，兩者互為因果，致屢孕屢墮、傷及胞臟[5]。補(bǔ)腎活血方補(bǔ)腎氣、通血瘀，寓通于補(bǔ)、以通為用，腎氣足、氣血暢，五臟調(diào)和。目前國(guó)內(nèi)已有報(bào)道證實(shí)補(bǔ)腎活血方在RSA 患者中取得一定效果[6-7]。

胎兒的發(fā)育和生長(zhǎng)與胎盤(pán)功能和血管發(fā)育有關(guān)，基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控是影響胎盤(pán)發(fā)育、功能的重要因素。miRNA 是主要的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，抑制目標(biāo)miRNA 的翻譯或誘導(dǎo)mRNA 降解可調(diào)節(jié)人類(lèi)60%左右的基因，miRNA 在妊娠期疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。國(guó)外最新研究指出早期妊娠丟失患者血液中的miR-423-5p 異常上調(diào)[8]。筆者推測(cè)抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者可能也存在miR-423-5p 異常表達(dá)情況，補(bǔ)腎活血方用于抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者是否可抑制miR-423-5p表達(dá)尚缺乏報(bào)道。本研究特通過(guò)前瞻性研究探討上述問(wèn)題，為中醫(yī)治療抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017 年5 月—2019 年12 月河南大學(xué)淮河醫(yī)院收治的抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者92 例。將患者分為對(duì)照組和研究組，每組46 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治的專(zhuān)家共識(shí)》[9]中原發(fā)性抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合《中醫(yī)婦科常見(jiàn)病診療指南》[10]的RSA 診斷標(biāo)準(zhǔn)，辨證為腎虛血瘀型；③未孕；④年齡23～40 歲；⑤有生育訴求。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲亢、妊娠；②合并免疫缺陷、傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾病及重要臟器功能障礙；③夫妻任意一方染色體異常；④生殖器官器質(zhì)性病變；⑤醫(yī)患溝通障礙者；⑥伴有嚴(yán)重貧血、代謝性疾病、內(nèi)分泌異常；⑦既往有吸毒史、藥物濫用史；⑧對(duì)本研究藥物過(guò)敏；⑨近3 個(gè)月內(nèi)未曾服用任何激素類(lèi)、免疫抑制類(lèi)藥物。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書(shū)。兩組患者臨床資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者臨床資料比較（n=46，）

表1 兩組患者臨床資料比較（n=46，）

1.2 方法

對(duì)照組給予常規(guī)西醫(yī)治療：口服阿司匹林腸溶片（國(guó)藥準(zhǔn)字H13023461，北京中新制藥廠(chǎng)），100 mg/次，1 次/d；口服地屈孕酮（批準(zhǔn)文號(hào)H20170221，荷蘭Abbott Biologicals B.V.公司），10 mg/次，2 次/d。研究組在對(duì)照組基礎(chǔ)上另給予補(bǔ)腎活血方治療，處方為：菟絲子30 g，續(xù)斷、桑寄生、阿膠各15 g，當(dāng)歸、川芎各6 g。上述藥物1 劑/d，常規(guī)煎熬濾至200 mL 藥汁，早晚各口服100 mL。兩組均持續(xù)治療8 周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 中醫(yī)證候評(píng)分 根據(jù)《中醫(yī)婦科常見(jiàn)病診療指南》[10]評(píng)估兩組治療前、治療后（持續(xù)治療8 周后）中醫(yī)證候評(píng)分，采用Linker4 級(jí)評(píng)分法評(píng)估主證：屢孕屢墮，小腹疼痛，腰膝酸軟/冷，每項(xiàng)0～6 分；次證：頭暈耳鳴、夜尿頻多、舌苔白膩或少苔、脈沉細(xì)弱或沉澀，每項(xiàng)0～4 分；主證、次證分?jǐn)?shù)越高表示病情越嚴(yán)重。

1.3.2 血管生成因子及蛻膜化標(biāo)志因子水平 分別于治療前后采集兩組患者空腹靜脈血，離心，收集血清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1（insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP-1）含量，試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 科技公司。

1.3.3 外周血miR-423-5p相對(duì)表達(dá)量 治療前后抽取患者靜脈血液3 mL，離心處理，收集血清，使用Qiacen RNeasy Mini 試劑盒提取血清總RNA，采用RNAiso for Small RNA 試劑（大連寶生生物工程有限公司）分離miRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（美國(guó)ABI 7500 Fast Real-Time PCR System PCR 儀）測(cè)定，反應(yīng)體系20 μL（基組DNA1μL、引物各0.5 μL、PCR 緩沖液10 μL、蒸餾水8 μL）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min（1 個(gè)循環(huán)），93℃變性30 s，53℃退火30 s，60℃拉伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。選用U6作為內(nèi)參，擴(kuò)增結(jié)束后繪制溶解曲線(xiàn)，以CT 值為基礎(chǔ)，2-ΔΔCT法計(jì)算外周血miR-423-5p 相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表2。

表2 PCR引物序列表

1.3.4 凝血功能變化 治療前后分別抽取靜脈血2.7 mL，枸櫞酸鈉抗凝，以3 500 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，收集血漿，采用全自動(dòng)血凝分析儀（ACL7000 型，美國(guó)貝克曼公司）檢測(cè)凝血酶原時(shí)間（prothrombin time,PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time,APTT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time,TT）、D-二聚體（D-dimer,DD）水平。

1.3.5 安全性 記錄兩組治療期間蕁麻疹、低燒、寒戰(zhàn)、紅細(xì)胞減少等不良事件發(fā)生情況。

1.3.6 近期預(yù)后 自治療開(kāi)始門(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng)2 年（妊娠后圍生期均給予規(guī)范化管理），記錄兩組患者妊娠及分娩情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后主證、次證中醫(yī)證候評(píng)分比較

兩組治療前后的主證、次證中醫(yī)證候評(píng)分的差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），研究組高于對(duì)照組。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者治療前后主證、次證中醫(yī)證候評(píng)分的差值比較（n=46，分，）

表3 兩組患者治療前后主證、次證中醫(yī)證候評(píng)分的差值比較（n=46，分，）

2.2 兩組患者治療前后血管生成因子及蛻膜化標(biāo)志因子比較

兩組患者治療前后TGF-β1、VEGF、IGFBP-1 的差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），研究組高于對(duì)照組。見(jiàn)表4。

表4 兩組患者治療前后血管生成因子及蛻膜化標(biāo)志因子的差值比較（n=46，）

表4 兩組患者治療前后血管生成因子及蛻膜化標(biāo)志因子的差值比較（n=46，）

2.3 兩組患者治療前后外周血miR-423-5p 相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組治療前后的miR-423-5p 相對(duì)表達(dá)量的差值為（0.41±0.07）ng/L，研究組為（0.60±0.08）ng/L，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.123，P=0.000），研究組高于對(duì)照組。

2.4 兩組患者治療前后凝血功能指標(biāo)比較

兩組患者治療前后PT、APTT、TT、DD 的差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），研究組高于對(duì)照組。見(jiàn)表5。

表5 兩組患者治療前后凝血功能指標(biāo)的差值比較（n=46，）

表5 兩組患者治療前后凝血功能指標(biāo)的差值比較（n=46，）

2.5 兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較

兩組不良反應(yīng)總發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.155，P=0.694）。見(jiàn)表6。

表6 兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較 [n=46，例（%）]

2.6 兩組患者預(yù)后比較

截止隨訪(fǎng)結(jié)束，對(duì)照組失訪(fǎng)3 例，研究組失訪(fǎng)2 例。兩組患者妊娠率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。兩組患者活產(chǎn)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），研究組高于對(duì)照組。見(jiàn)表7。

表7 兩組患者預(yù)后比較 例（%）

3 討論

RSA 具有較為復(fù)雜的病理過(guò)程，近年來(lái)大量研究證實(shí)了miRNA 在RSA 病理過(guò)程中的作用。DING等[11]研究指出RSA 患者中miR-146b-5p 異常高表達(dá)，M1 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡通過(guò)靶向TRAF6 傳遞miR-146a-5p，抑制滋養(yǎng)層遷移和侵襲，參與RSA 的發(fā)病機(jī)制。ZHU 等[12]研究顯示抑制miR-30a-5p 可逆轉(zhuǎn)circPUM1 誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞功能障礙及炎癥反應(yīng)。GAO 等[13]研究指出miR-143-3p 在RSA 中上調(diào)，miR-143-3p 上調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程及滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。RSA 在母胎界面涉及多種因素和多種細(xì)胞成分，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源于侵入的滋養(yǎng)細(xì)胞，是胎盤(pán)的重要組成部分，在胚胎著床和妊娠中發(fā)揮重要作用。絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞從附著的胚胎遷移并侵入子宮上皮和螺旋動(dòng)脈，從而建立母胎聯(lián)系并提供信號(hào)以確保母體免疫細(xì)胞保持對(duì)胚胎的抵抗力。此外滋養(yǎng)層上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)、維持與母胎界面的免疫微環(huán)境密切相關(guān)，滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲不足在抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。母胎界面的細(xì)胞間通信對(duì)于維持絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、遷移至關(guān)重要，miR-423-5p 作為絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、遷移的信號(hào)傳遞因子之一，補(bǔ)腎活血方干預(yù)抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者是否影響其外周血miR-423-5p的表達(dá)值得探討。

本研究顯示研究組治療前后的中醫(yī)證候評(píng)分差值高于對(duì)照組，提示補(bǔ)腎活血方治療抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者可改善其臨床癥狀。中醫(yī)的辨證施治在抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 治療方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)認(rèn)為血?dú)獠蛔?、腎虛為墮胎病機(jī)所在，腎藏精主生殖，是胎孕之本，腎虛則沖任不盛，胞宮攝精不足成孕，抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者屢孕屢墮，胞絡(luò)反復(fù)受損致惡性循環(huán)。補(bǔ)腎活血方寓攻于補(bǔ)，攻血瘀、宣腎氣以促瘀滯解除，升降脾胃氣機(jī)以養(yǎng)腎陰精血。補(bǔ)腎活血方由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠、當(dāng)歸、川芎精制而成，方中菟絲子是補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目、固胎止泄的妙藥，續(xù)斷是補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、調(diào)血脈、止崩漏的良藥，桑寄生祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎，當(dāng)歸潤(rùn)腸通便、活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛，阿膠滋陰潤(rùn)燥、補(bǔ)血止血、利水消腫，川芎活血行氣、開(kāi)郁燥濕、活血化瘀，諸藥合用，共奏補(bǔ)腎活血、固沖安胎之功。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)補(bǔ)腎活血法用于治療不孕癥可調(diào)節(jié)卵巢生殖內(nèi)分泌功能，調(diào)節(jié)卵巢血流供應(yīng)，改善卵巢局部微環(huán)境及子宮著床微環(huán)境[14]；菟絲子黃酮類(lèi)物質(zhì)和天然孕酮分子結(jié)構(gòu)較為相似，具有促進(jìn)胎盤(pán)血流灌注、合體滋養(yǎng)細(xì)胞孕激素分泌等功效[15]。

本研究顯示研究組治療前后的TGF-β1、VEGF、IGFBP-1 差值均高于對(duì)照組，說(shuō)明補(bǔ)腎活血方治療抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者提高血管生成因子及蛻膜化標(biāo)志因子水平更明顯。研究組治療前后的PT、APTT、TT、DD 差值均高于對(duì)照組，提示補(bǔ)腎活血方治療抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者改善血栓及凝血功能指標(biāo)更明顯。研究組治療前后的miR-423-5p 相對(duì)表達(dá)量差值高于對(duì)照組，提示補(bǔ)腎活血方用于抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 抑制miR-423-5p 表達(dá)更明顯。筆者推測(cè)可能與以下因素有關(guān)：補(bǔ)腎活血藥物能夠促進(jìn)抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者內(nèi)源性激素分泌，有利于維持其子宮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)母體保護(hù)性免疫功能；活血化瘀藥物改善抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者凝血功能，降低血液黏度、血流阻力，調(diào)整血瘀狀態(tài)下紊亂的免疫功能，并且可促進(jìn)血管生成因子及蛻膜化標(biāo)志因子合成，有助于蛻膜發(fā)育與抗原抗體復(fù)合物吸收，促進(jìn)血管生成參與宮內(nèi)膜的蛻膜轉(zhuǎn)換，便于胚胎與母體間的物質(zhì)交換，以便胚胎種植、維持妊娠正常進(jìn)行，進(jìn)而影響目標(biāo)miR-423-5p 的翻譯表達(dá)。但關(guān)于補(bǔ)腎活血藥物對(duì)抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者miR-423-5p 表達(dá)的具體作用機(jī)制尚不明確，后期仍需更完善的研究進(jìn)一步探討。研究組活產(chǎn)率高于對(duì)照組，再次印證了補(bǔ)腎活血方治療抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者的效果。

綜上所述，補(bǔ)腎活血方干預(yù)可減輕抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者病情，改善血管生成因子、蛻膜化標(biāo)志因子、凝血功能，抑制miR-423-5p 表達(dá)也較明顯，可提升活產(chǎn)率，且安全性良好。受時(shí)間、精力、人員等情況限制，本研究樣本量有限、隨訪(fǎng)時(shí)間有限，后期仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步佐證本研究結(jié)論，miR-423-5p 在抗磷脂抗體陽(yáng)性RSA 患者中的具體作用機(jī)制也將作為筆者下一步研究重點(diǎn)。