結球甘藍抽薹過程中抗氧化系統及蛋白質含量的變化

王神云，余方偉，張 偉，于 利，李建斌

(江蘇省農業科學院 蔬菜研究所，南京 210014)

結球甘藍(BrassicaoleraceaL var.capitata. L.，簡稱甘藍)俗稱包菜、圓白菜、茴子白等，是十字花科主要蔬菜作物之一，屬綠體春化作物，即一定大小的植株通過一定的低溫作用后，當溫度和光照條件合適后誘導植株抽薹開花，完成世代[1-2]。春甘藍生產中，經常會發生“未熟抽薹”現象，嚴重影響產品產量和質量；在甘藍育種中，一些材料需促進抽薹，才能保證收到種子；在甘藍F1代種子生產中，一些品種雙親需調節抽薹時間，保障兩本花期相遇，增加種子產量和質量。因此，甘藍抽薹過程的調控無論在生產中還是育種中都尤為重要。

植物抽薹是由系列內因和外因共同作用的過程，因此抽薹成花過程中不僅成花途徑的相關分子因子，如FLC、CO、FT、miRNA156、miRNA159等會發生表達量或結構等的變化[3-4]，而且也會發生復雜的生理生化反應，如系列抗氧化酶、糖、蛋白質、激素等物質的活性和含量的變化[5-7]。十字花科蔬菜白菜從營養生長到盛花抽薹過程中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)及可溶性蛋白(S-Pr)和丙二醛(MDA)含量的變化呈現一定的規律性，而且易抽薹和晚抽薹材料之間存在明顯的差異，表明這些生理指標和白菜抽薹有一定的聯系[6]。十字花科蔬菜蘿卜從花芽未分化到薹高>5cm的抽薹過程中保護酶SOD、POD和CAT的活性與可溶性糖和S-Pr含量也發生趨勢性變化，說明蘿卜抽薹過程也需要一些生理生化物質的參與[8]。甘藍抽薹必需經過一段低溫春化，前人研究表明甘藍通過低溫春化階段，可溶性糖、S-Pr、游離氨基酸含量積累，而淀粉和全氮含量卻顯著下降[9-10]，抗氧化系統酶CAT、POD和SOD的活性隨著低溫的積累也降低[11]；通過春化階段后進入花芽分化階段，花芽分化過程蛋白質和蔗糖含量表現為下降趨勢[12]；花芽分化后到現蕾蛋白質和蔗糖的含量又升高[12]，因此，甘藍抽薹過程中大量的代謝物質發生規律性變化趨勢，與抽薹有一定聯系。前期研究主要在甘藍低溫春化、花芽分化和現蕾這幾個時期生理生化的分析，甘藍現蕾到開花還有一個花薹伸長和分枝的生長過程，這個階段的生理生化研究屬于空白，本試驗在前人研究的基礎上，利用抽薹性差異明顯表型穩定的兩份甘藍材料，研究分析甘藍通過低溫春化后到開花抽薹過程中抗氧化系統的幾個酶活性、MDA和S-Pr含量變化進行研究，以期明確甘藍抽薹發育后期抗氧化系統生理指標變化規律，進而為甘藍類蔬菜階段發育調控過程研究和人工調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為兩份高代自交系甘藍，耐抽薹甘藍CF11-1-6-4(簡稱CF)和易抽薹甘藍c179-1-4(簡稱c179)，由江蘇省農業科學院蔬菜研究所提供。兩份供試材料第1批播種于9月20日，定植于10月28日；第2批播種10月10日，定植于11月21日，試驗在江蘇省農業科學院蔬菜研究所試驗地進行，育苗和田間肥水管理同生產管理。

1.2 測定指標及方法

于2021年3月8日、3月15日、3月22日、3月29日、4月5日和4月12日(c179始花)每隔 7 d進行莖粗和抽薹率調查并采集樣品。莖粗用直尺測定15個植株莖最粗部位的直徑；調查已測量莖粗植株的抽薹性(薹高5 cm即為抽薹)，抽薹 率=抽薹植株數/15×100%。

精確稱取心葉數起第4片葉樣品0.3 g，放入滅菌研缽，加入3 mL磷酸緩沖液(含0.2 mmol·L-1EDTA，pH 7.8)置于冰上研磨成勻漿， 11 000g4 ℃離心25 min，上清液用于測定MDA和S-Pr含量及各種酶的活性。SOD活性采用氮藍四唑(NBT)法[13]測定。CAT活性參考Angela等的方法[14]測定。APX、G-POD活性參考朱祝軍等的方法[15]測定。MDA含量參照Cakmak等的方法[16]測定。S-Pr含量采用考馬斯亮藍G-250染色法[17]測定。

1.3 數據處理

測定數據采用Excel 2016、SPSS 26.0軟件進行方差分析(LSD多重比較)和作圖。

2 結果與分析

2.1 不同定植時間甘藍莖粗和抽薹情況

由表1可知，定植時間的早、晚影響甘藍莖的生長量，兩個材料定植早的莖均比定植晚的粗，而且易抽薹材料c179莖的生長速度快于耐抽薹材料CF(表1)，c179于11月21日定植的莖的生長量也快于CF于10月28日定植。兩個材料的耐抽薹性差異大，易抽薹材料c179，10月28日定植和11月21日定植，3月22日均發生現蕾現象，定植早比定植晚抽薹率高10%，3月29日抽薹率均達到100%；耐抽薹材料CF于10月28日定植后到第2年4月5日開始抽薹，比c179晚14 d，4月12日只有25%的植株發生抽薹，抽薹率低于c179材料75%，于11月21日定植沒有發生抽薹現象，沒有發生抽薹現象的均沒有通過低溫春化，表明耐抽薹材料CF通過綠體春化對植株生長量要求明顯高于易抽薹材料c179。

表1 兩個甘藍不同定植時間莖粗和抽薹率Table 1 The stem diameter and bolting rate of the two cabbage lines at different planting time

2.2 甘藍抽薹過程CAT活性變化

耐抽薹CF和易抽薹c179，從3月8日-4月12日，定植早、晚6個時間點CAT活性變化趨勢基本一致。兩個材料定植早的CAT變化是3月15日稍微升高，3月22日迅速升高，3月29日活性又降低，4月5日到4月12日繼續降低；兩個材料定植晚的CAT活性變化3月15日稍降低，其他時間點變化趨勢基本同于定植早的(圖1)。3月22日c179發生現蕾現象而CF沒有發生現蕾現象，但兩個材料的CAT活性在這個時間點都迅速升高，而且它們定植早、晚沒有同時表現顯著差異，而且定植早的耐抽薹CF在4月5日部分發生現蕾現象，但其CAT活性同其他變化趨勢一致，表現下降(表1，圖1)，4月12日c179(始花期)定植早、晚的CAT活性極顯著低于CF。甘藍通過低溫春化后現蕾前兩周到始花前的抽薹過程中CAT活性的變化規律表明其活性的變化與抽薹相關性不強，但可能與開花有關。

CF-E、CF-L、c179-E、c179-L表示定植早、晚的耐抽薹材料CF和易抽薹材料c179；大、小寫字母表示同一日期兩個材料定植早、晚間差異極顯著水平(P<0.01)和顯著水平(P<0.05)。 下同

2.3 甘藍抽薹過程APX活性變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的APX活性3月8日-4月12日變化規律不一致。易抽薹材料c179定植早、晚的APX活性變化規律稍有不同，定植早的APX活性3月8日到3月15日緩慢上升，3月22日下降到低于3月8日，3月29日又緩慢上升，隨后開始下降，而定植晚的APX活性在3月29日稍有下降，但與定植早的不存在差異，但高于耐抽薹CF的活性，其他時間點活性變化趨勢一致(圖2)；耐抽薹CF定植早的APX活性3月8日到3月22持續上升，3月29驟然下降，后期活性緩慢下降，定植晚的APX活性變化規律基本與定植早的趨勢相似，3月8日和3月22日分別比定植早的強和弱(圖2)。在抽薹過程中，易抽薹c179無論定植早、晚3月15日(現蕾前1周)和3月29日(現蕾后第1周)活性強于耐抽薹CF，現蕾前1周定植早的存在顯著差異，定植晚的差異不顯著，現蕾后1周定植早的存在極顯著差異，定植晚的差異不顯著；3月22日(現蕾)和4月12日(始花)弱于CF(表1，圖2)，現蕾期定植早的存在顯著差異，定植晚的差異不顯著，始花期存定植早、晚存在極顯著差異。上述甘藍抽薹過程APX活性變化規律，表明APX活性可能與現蕾前1周、現蕾后第1周及始花過程有關。

圖2 甘藍抽薹過程中APX活性Fig.2 APX activities during bolting process of cabbage

2.4 甘藍抽薹過程G-POD活性變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的G-POD活性3月8日-4月12日變化規律基本一致，3月15日先升高，3月22日除了定植早的CF的G-POD活性上升，其他均下降，3月29日除了定植早的CF的G-POD活性下降幅度大，其他均與3月22日活性相當，4月5日G-POD活性下降，4月12日CF的G-POD活性稍有上升，而c179的仍有下降(圖3)。3月8日和3月15日(現蕾前2周)定植早、晚的易抽薹c179的G-POD活性極顯著高于CF，4月12日(始花)極顯著低于CF(表1，圖3)；3月22日定植早的耐抽薹材料CF的G-POD活性突然上升(部分材料現蕾前2周)，極顯著高于其他樣品(表1，圖3)，3月29日也極顯著高于定植晚的活性。3月8日、3月15日易抽薹材料c179和3月29日定植早的耐抽薹材料CF雖沒有現蕾，但通過花芽分化的材料抽薹已啟動，因此表明G-POD活性可能與甘藍抽薹啟動發育階段和始花相關。

圖3 甘藍抽薹過程中G-POD活性Fig.3 G-POD activities during bolting process of cabbage

2.5 甘藍抽薹過程SOD活性變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的SOD活性3月8日-4月12日變化規律基本一致，3月15日基本不變，3月22日升高(除了定植早的CF)，3月29日驟然下降，4月5日又升高，4月12日又略有下降(圖4)。3月8日定植早的CF和c179的SOD活性比定植晚的強，3月15日定植早的CF和c179的SOD活性比定植晚的極顯著高約100 U·min-1·g-1；3月22日定植早的CF的SOD活性驟然下降，c179變化不大，兩個材料定植晚的SOD活性均上升；4月5日和4月12日兩個材料定植早的SOD活性比定植晚的低，存在一定差異，但定植早的CF的SOD活性略有上升，可能與材料特性有關；從3月8日到4月12日CF和c179定植早的SOD活性基本都比定植晚的強(圖4)，除了3月22日定植早的CF的SOD活性，上述SOD活性變化規律，表明SOD活性的變化與甘藍通過低溫春化后的抽薹過程相關不強，可能與材料的特性、植株的大小和生長狀態有關。

圖4 甘藍抽薹過程中SOD活性Fig.4 SOD activities during bolting process of cabbage

2.6 甘藍抽薹過程丙二醛含量變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的MDA含量3月8日-4月12日變化規律有差異，易抽薹c179，3月15日升高，3月22日下降，3月29日定植早的有上升現象而定植晚的持續下降，4月5日升高，4月12日定植早的急劇上升，而定植晚的略升高；耐抽薹材料CF于3月15日、4月5日和4月12日與c179變化趨勢一致，3月15日定植早、晚的含量顯著和極顯著低于c179(現蕾前1周)，3月22日定植早的CF(部分植株現蕾前1周)的MAD含量上升，與c179現蕾前1周變化趨勢相同(圖5)，4月5日定植早的含量極顯著低于c179(現蕾后第2周)，定植晚的含量不存在顯著差異，4月12日兩個材料定植早的含量極顯著高于定植晚的(圖5)。上述丙二醛含量的變化規律，表明丙二醛含量在甘藍通過低溫春化后整個抽薹過程中在現蕾前1周、現蕾后第2周可能發揮一定的作用。

圖5 甘藍抽薹過程中MDA含量Fig.5 MDA contents during bolting process of cabbage

2.7 甘藍抽薹過程可溶性蛋白含量變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的S-Pr含量3月8日-4月12日變化規律基本一致，3月8日兩個材料定植早的含量比定植晚的極顯著偏低，3月15日兩個材料定植早的S-Pr含量升高，定植晚的下降，c179(現蕾前1周)的S-Pr含量高于CF，而且定植晚的含量存在極顯著差異，3月22日兩材料定植早、晚的含量都升高，3月29日到4月5日持續下降，但3月29日和4月5日c179現蕾后第1、2周定植晚的S-Pr含量顯著和極顯著高于CF；定植早的含量不顯著和極顯著高于CF，4月12日兩材料S-Pr含量均升高(表1，圖6)，定植早的CF含量最低，可能與部分植株進入現蕾第2周時期有關。上述S-Pr含量的變化規律，表明S-Pr含量在甘藍通過低溫春化后的抽薹過程中可能在現蕾前1周和現蕾后第1、2周存在一定的關系。

圖6 甘藍抽薹過程中S-Pr含量Fig.6 S-Pr contents during bolting process of cabbage

3 討 論

甘藍抽薹是通過低溫春化頂端分生組織完成花芽分化后遇到合適的溫度和光照花薹從葉叢中伸長生長，此階段發育不僅受內部因素調控，而且受溫度、光照等環境因素的影響，是典型的數量性狀，受多個基因控制[18-20]，還與多種代謝物質有關系，如蛋白質、糖及各類內源激素等[9-12]。甘藍春化作用的效果是花發端，而花發端不是發生在春化過程中，卻是發生在春化之后適合生長的條件下。甘藍屬于綠體春化，需要植株長到一定大小才能感受低溫，本研究所利用的易抽薹材料c179在11月21日定植和10月28日定植均達到了春化要求，春化結束后莖粗達到1.3 cm以上，耐抽薹材料CF莖的生長量比c179小0.4 cm左右，10月28日定植后的植株部分通過低溫春化，11月21日定植完全沒有通過低溫春化，說明不同基因型的甘藍感受低溫春化植株的大小要求不同，而且同一基因型植株營養體越大所需低溫積累時間相對短，與王超等[21]建立甘藍抽薹鑒定的方法研究結果一致，而且與吳國平等[2]研究結果也一致。在自然生長的條件下，就甘藍春化、抽薹甚至開花發育的進程而言，耐抽薹和易抽薹材料是相似的，只是發育進程時間遲早有差別，因而，不同品種與抽薹有關的生理代謝活動可能相似，那么相關酶的活性和可溶性蛋白含量的變化也就應該具有相同的規律，只是變化的遲早可能因發育進程而存在差異。甘藍通過低溫春化過程抗氧化系列的保護酶，如SOD、CAT、POD等及蛋白質、蔗糖的含量會發生趨勢變化，可作為甘藍通過前期低溫積累的生化標記[11-12]。本研究中易抽薹材料c179不同定植時間通過春化后到始花整個抽薹過程CAT、APX和G-POD活性、MDA和S-Pr含量可能發揮了一定的作用。甘藍CAT雖然可以作為前期低溫積累的生化指標[11]，與蘿卜相似[22]，在抽薹過程中可能與抽薹沒有直接關聯，但本研究結果表明CAT可能有助于甘藍開花；本研究APX活性在易抽薹c179和的耐抽薹CF中的變化規律和差異表明其在甘藍現蕾前1周、現蕾后第1周和始花期發揮一定的作用；G-POD活性與甘藍現蕾前兩周和始花時期相關性強，在擬南芥和青花菜低溫春化過程中POD活性是慢慢增強的[23-24]，POD是細胞防御活性氧對細胞傷害的保護酶，而且POD也具有氧化分解IAA的作用，IAA在植物抽薹開花過程中發揮重要作用[22,25-26]，本研究中G-POD可能在甘藍抽薹過程中參與激素調控，變化趨勢同十字花科蕓薹屬不結球白菜[6]；MDA在現蕾后第2周可能發揮一定的作用，MDA是低溫春化后的一個響應物質，在甘藍、蘿卜、洋蔥中都會升高[11,22,27]，本研究中甘藍現蕾后第1周含量下降，第2周到初花稍有上升，變化規律同不結球小白菜抽薹過程[6]，但現蕾第2周易抽薹和耐抽薹材料含量存在顯著和極顯著差異，可能在這個時期發揮一定作用； S-Pr在甘藍現蕾后第1周和第2周發揮一定的作用，表明蛋白質可能作為物質基礎促進甘藍這2周薹長高的生長過程，與蘿卜抽薹過程可溶性蛋白含量變化規律相反，可能與蘿卜抽薹后營養物質向塊根轉移有關[22]，白菜通過春化后到始花 S-Pr含量一直上升[6]，而本研究中甘藍現蕾后2周下降到始花又上升，可能不同的作物存在差異；兩個材料的SOD活性的變化在抽薹過程中變化規律基本一致，它們可能與甘藍現蕾前2周到始花過程關聯不大。甘藍抽薹是一個復雜的發育過程，生理生化物質的變化可以作為抽薹過程內因或外因調控的指示，有助于調控機理的解析而且可以為人工調控階段發育提供理論依據。

4 結 論

甘藍通過低溫春化存在基因型差異，抗氧化系統酶CAT、APX、G-POD及MDA和S-Pr含量5個生理指標在現蕾前2周到始花整個過程在一些發育時段發揮重要作用，說明了甘藍抽薹過程的復雜性，這些生理生化物質在甘藍抽薹過程中所起作用以及如何起作用，需要從多方面深入細致的研究。