小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠的作用及機制*

楊 亮 ，王 超 ，章子臻 ，張 彥 ，陶 瑞 ，耿嘉浩 ，董 艷 ，王紫翰 ，胡慧子 ，儲兆億 ，馬增春 ，洪 倩

（1. 徐州醫科大學附屬淮海醫院·中國人民解放軍陸軍第七十一集團軍醫院，江蘇 徐州 221004； 2. 合肥師范學院化學與化學工程學院，安徽 合肥 230601； 3. 吉林敖東醫藥有限責任公司，吉林 延吉 133700； 4. 軍事科學院軍事醫學研究院，北京 100850）

小兒柴桂退熱口服液主要成分為柴胡、桂枝、黃芩，具有發汗解表、清里退熱功效，對三聯菌致發熱模型家兔和酵母菌致發熱模型大鼠均有明顯的解熱作用，對小鼠耳腫脹、大鼠足腫脹和毛細血管通透性等有抑制作用，抗炎作用顯著［1］。此外，還具有顯著的抗病毒作用，能明顯降低小鼠熱痛反應和醋酸致小鼠抱體反應次數，提高小鼠單核巨噬細胞系統的吞噬功能及血清溶血素水平，可用于鎮痛和增強機體免疫功能［2］。中藥復方對新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者的康復有重要作用［3］。脂多糖（LPS）誘導的小鼠肺組織感染模型與臨床病毒感染相似，是模擬新型冠狀病毒感染的理想替代動物模型［4-5］。核轉錄因子 - κB（NF- κB）蛋白最早是由David Baltimore 發現，該蛋白家族可選擇性地結合在B 細胞κ - 輕鏈增強子上調控許多基因的表達。幾乎所有動物細胞中都能發現NF - κB，其參與細胞對外界刺激的響應，如細胞因子、輻射、病毒等。免疫細胞通過Toll 樣受體（TLR）、視黃酸誘導基因蛋白I（RIG - I）樣受體（RLR）、核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）樣受體（NLR）等模式識別受體（PRR）對機體內環境的變化進行免疫監視，實現固有免疫系統功能。NLR 家族是位于胞質內的一類PRR，可識別病原相關分子模式或損傷相關分子模式，與銜接蛋白結合形成致密的蛋白復合體，即炎性小體，誘導半胱氨酸活化酶1（Caspase-1）剪切活化［6］，活化的 Caspase-1可促進炎性因子白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素18（IL-18）加工、成熟和分泌，并介導細胞焦亡。活化的NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎性小體在各種病原體感染、腫瘤等多種疾病的發生、發展過程中起重要作用［7］。因此，本研究中探討了小兒柴桂口服液對LPS誘導肺損傷模型小鼠的作用及機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：NIKON E80i型顯微鏡（尼康儀器<上海>有限公司）；HF90 型37 ℃恒溫箱（上海力申科學儀器有限公司）；FC5515R 型微量高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；85-2型數顯恒溫磁力攪拌器（常州普天儀器制造有限公司）；EPS 300 型電泳儀（北京中西華大科技有限公司）；DS-H200 型水平搖床（武漢塞維爾生物科技有限公司）；DW - 86L626 型醫用低溫冰箱、BCD - 248W 型普通冰箱（青島海爾生物醫療股份有限公司）；IMS - 20 型制冰機（上海燕豐廚業有限公司）；GDSFJ 型酶標儀（三豐精密量儀有限公司）；5200 Multi 型化學發光成像儀（上海天能科技有限公司）；BC-2800 vet 型邁瑞獸用全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）。

試藥：LPS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為J2111625）；小兒柴桂退熱口服液（吉林敖東藥業集團股份有限公司，批號為2107005）；連花清瘟膠囊（石家莊以嶺藥業有限股份公司，批號為A2111057）；蘇木素-伊紅染液（HE，上海碧云天生物技術有限公司，批號為081120201016）；腫瘤壞死因子 - α（TNF- α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號為DG30048M -96），IL-1β ELISA試劑盒（批號為DG30045M-96），均購自北京東歌博業生物科技有限公司；超敏增強型化學發光（ECL）試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號為CR2120085）；甘油醛 - 3- 磷酸脫氫酶（GAPDH，批號為 301341）；NF - κB（批號為 ab32536），NLRP3（批號為ab263899），IL - 1β（批號為ab254360），均購自艾博抗上海貿易有限公司。

動物：60只雄性KM 小鼠，體質量（20 ± 2）g，購于安徽省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SYXK（皖）2020 - 001，飼養于12 h/ 12 h 明暗交替、溫度23～25 ℃的環境中。動物實驗經合肥師范學院實驗動物倫理委員會審批，實驗設計符合動物倫理要求，實驗操作人員經過動物實驗考核合格。

1.2 方法

分組、建模與給藥：按隨機數字表法將60只小鼠分為空白對照組（A組），模型對照組（B組），小兒柴桂口服液低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組），陽性對照組（D 組），各10 只。除A 組外，其余各組小鼠均一次性尾靜脈注射LPS 5 mg/kg，以建立肺損傷模型。D組小鼠灌胃溶于生理鹽水的連花清瘟膠囊5 mg/kg，C1組、C2組、C3組小鼠分別灌胃8，16，32 mg/ kg 小兒柴桂口服液，A組和B組小鼠灌胃等量生理鹽水，均連續給藥3 d。

肺組織干/濕質量比測定：取肺組織適量，稱定質量，即為濕重；60 ℃烘干72 h，稱定質量，即為干重。干/濕質量比（%）=干重/濕重×100%。

血液常規分析：采用BC-2800vet 型邁瑞獸用全自動血液細胞分析儀檢測各組小鼠的血常規，包括白細胞計數（WBC）、中性粒細胞計數（NEUT）、紅細胞比容（HCT）、血小板計數（PLT）、血紅蛋白（Hb）、紅細胞分布寬度變異系數（RDW-CV）、紅細胞分布寬度的標準差（RDW -SD）、淋巴細胞（LYMPH）、單核細胞（MONO）、嗜堿性粒細胞（BASO）。

小鼠肺組織病理變化觀察：每組隨機選取3 只小鼠，取肺組織，用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋并制作厚度為1 mm 的切片，用HE 染色，顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

炎性因子水平測定：按ELISA試劑盒說明書測定各組小鼠血漿中炎性因子TNF-α和IL-1β的水平。

免疫印跡（Western blot）法檢測小鼠肺相關蛋白表達水平：每組隨機選取3 只小鼠，取肺組織，提取總蛋白，BCA 法檢測總蛋白含量。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE），300 mA 轉膜1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入GAPDH（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、NF- κB（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）一抗，4 ℃下孵育過夜，TBST 洗滌 3 次，每次 5 min，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，最后加入ECL 超敏發光液，曝光，使用Image J軟件統計灰度值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 肺干/濕質量比

與A 組比較，B 組小鼠肺組織干/濕質量比顯著降低（P<0.01）；與B組比較，C2組、C3組、D組小鼠肺組織干/濕質量比均顯著升高（P<0.01）。詳見圖1。

圖1 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠肺干/濕質量比的影響Fig.1 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the dry/wet weight ratio of lung tissue of LPS-induced lung injury model mice

2.2 肺組織形態及病理變化

B 組小鼠肺組織水腫程度明顯，表面有斑點形成，出現滲出、水腫或炎性浸潤；D 組小鼠腸道組織炎性浸潤損傷程度顯著降低；與B 組比較，C1組、C2組、C3組小鼠腸道組織炎性癥狀均有減輕，表明小兒柴桂退熱口服液能抑制LPS 誘導的肺損傷模型小鼠肺組織的急性損傷。詳見圖2。

圖2 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠肺組織形態學的影響（n = 3）Fig.2 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the morphological changes of lung tissue of LPS-induced lung injury model mice（n=3）

2.3 血液生化指標

與 A 組比較，B 組小鼠外周血 WBC，PLT，LYMPH水平均顯著降低，HCT 和NEUT 比例（NEUT%）水平均顯著升高（P<0.05）；與B 組比較，C2組、C3組小鼠外周血WBC，PLT，LYMPH 水平均顯著升高，HCT 和NEUT%均顯著降低（P<0.05），表明小兒柴桂退熱口服液能顯著增加LPS 誘導肺損傷模型小鼠的WBC，PLT，LYMPH數量，且呈量效正相關；C2組、C3組的作用強度均優于D組。詳見表1。

表1 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠血漿中血液生化指標的影響（）Tab.1 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the blood biochemical indexes in plasma of LPS - induced lung injury model mice（）

表1 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠血漿中血液生化指標的影響（）Tab.1 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the blood biochemical indexes in plasma of LPS - induced lung injury model mice（）

指標WBC（× 109/L）NEUT%MONO%BASO%NEUT（× 109/L）LYMPH（× 109/L）MONO（× 109/L）BASO（× 109/L）Hb（g/L）HCT（%）RDW-CV（%）RDW-SD（fL）PLT（× 109/L）A組4.41±1.19 5.47±3.87 3.88±7.14 8.52±3.13 0.22±0.18 3.53±1.14 0.19±0.39 0.37±0.17 179.75±35.07 50.75±8.99 23.13±2.70 30.43±2.04 209.38±98.24 B組1.16±0.82*20.21±13.33*6.11±3.59*11.20±7.06*0.28±0.39 0.71±0.45*0.06±0.03*0.11±0.07*191.75±10.33 71.98±49.39*24.98±1.99 30.71±11.37 124.75±23.81*C1組C2組C3組2.17±0.91 28.26±13.81 6.31±3.18 10.31±7.64 0.52±0.26 1.03±0.42#0.11±0.06 0.21±0.16 138.63±14.77 40.81±3.84#19.61±2.13 29.83±2.27 187.25±46.40#2.74±1.2#18.22±5.62#4.33±3.7#11.84±7.98 0.41±0.14 1.47±0.32#0.10±0.09 0.33±0.28#137.25±10.42 40.65±3.07#19.46±1.81 28.84±2.91 205.63±96.98#2.28±0.81#15.64±11.01#3.39±1.99#13.41±9.54 0.36±0.26 1.38±0.49#0.07±0.05 0.26±0.2 136.50±5.88 40.38±1.77#19.85±0.97 29.56±2.44 208.50±65.61#D組1.54±0.85#13.32±2.68#2.69±0.81#11.48±2.23 0.31±0.06 0.93±0.52#0.06±0.01 0.23±0.04 71.19±75.41 21.07±22.29 10.41±10.90 16.00±15.66 137.05±82.50

2.4 血漿中炎性因子水平

與 A 組比較，B 組小鼠血漿中炎性因子 IL - 1β 和TNF- α 表達水平均顯著升高（P<0.01）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組小鼠血漿中IL-1β 和TNF- α 表達水平均顯著降低（P<0.05），表明小兒柴桂退熱口服液能顯著增加LPS誘導的肺損傷模型小鼠的炎性變化，且呈量效正相關；C2組的作用強度與D 組相當，C3組的作用強度優于D組。詳見圖3。

圖3 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠血漿中炎性因子水平的影響Fig.3 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the inflammatory factor levels in plasma of LPS-induced lung injury model mice

2.5 肺組織中NF-κB/NLRP3 通路蛋白表達水平

與 A 組比較，B 組小鼠肺組織中 NLRP3，NF - κB，IL-1β 蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）；與B 組比較，C2組、C3組、D 組小鼠肺組織中 NLRP3 蛋白表達水平均顯著降低（P< 0.05），C1組、C2組、C3組、D 組小鼠肺組織中NF-κB 和IL-1β 蛋白表達水平均顯著降低（P< 0.05），表明小兒柴桂退熱口服液可能通過抑制NF- κB 和 IL-1β 蛋白介導的 NLRP3 蛋白活化通路而改善LPS誘導的肺損傷模型小鼠的肺部損傷。詳見圖4。

圖4 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠肺組織中NF-κB/NLRP3通路蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the expression level of NF-κB/NLRP3 pathway protein in lung tissue of LPS-induced lung injury model mice

3 討論

小兒柴桂退熱口服液是臨床常用中藥制劑，具有發汗解表、清里退熱作用。方中，柴胡、葛根藥性辛涼，可升陽解肌、退熱透疹；桂枝、白芍解肌發熱，益陰斂營，調和營衛；黃芩清邪郁所化之熱；蟬蛻、浮萍退肺熱，清里退熱。諸藥合用，共奏清熱利濕、解毒透疹功效［8］。LPS 誘導的急性肺損傷動物模型可最大限度地表征COVID - 19 感染引起的肺損傷，誘導的氧化應激反應與其濃度呈劑量依賴效應［9］。在較低濃度下，LPS 濃度升高會促進機體抗氧化能力上升，但細胞內的抗氧化防御體系仍不能阻止LPS對蛋白質的氧化損傷。參考文獻［10 - 13］，本研究中以小鼠尾靜脈注射5 mg/ kg LPS 建立肺炎模型，組內差異小。本研究結果顯示，與A 組比較，B 組小鼠肺組織干/濕質量比和WBC 均顯著降低；與B 組比較，C2組和C3組小鼠肺組織病理損傷改善顯著提高。可能與柴胡具有抑菌殺菌、抗病毒作用，葛根具有增強人體免疫力等作用［14］，黃芩具有廣泛的抗菌作用有關。

NF-κB 在細胞的炎癥、免疫應答等過程中均起關鍵性作用，若錯誤調節會引發自身免疫性疾病、慢性炎癥及癌癥，同時與突觸的可塑性、記憶有關［15］。NF-κB家族蛋白包括同源性或異源性二聚體轉錄因子，能與免疫球蛋白κ 輕鏈基因增強子B 位點特異性結合，廣泛存在于各種細胞中，在細胞受到病毒或細菌感染、氧自由基、DNA 損傷、細胞因子、LPS、紫外線照射等因素刺激后可被活化，通過參與一系列免疫反應、炎性反應，調控細胞及凋亡的基因轉錄（如細胞因子、生長因子、趨化因子、黏附分子、免疫受體基因），影響體內的細胞分化、炎性反應、免疫反應、腫瘤生長、細胞凋亡等［16］。作為炎癥的中央調節因子，NF - κB 控制趨化因子、細胞因子、促炎黏附分子和促炎轉錄因子的基因轉錄，激活的NF-κB 可轉移到細胞核，并與促炎基因的啟動子結合，導致基因表達增強和炎性反應擴增，最終導致組織炎性損傷［17］。因此，阻斷NF- κB 轉錄活性可能是治療炎性疾病的重要靶點。研究表明，NF - κB 活化水平的免疫調節、NF- κB 降解抑制劑、TNF- α 的抑制可能會導致細胞因子風暴減少，并減輕COVID- 19 的嚴重程度，故抑制NF - κB 通路在緩解 COVID - 19 的嚴重程度方面具有潛在作用［18］。

NLR家族是一類位于胞質內的PRR，可與銜接蛋白和 Caspase - 1 結合形成炎性小體，如 NLRP1，NLRP3，NLRP7等。其中，NLRP3炎性小體活化需2個信號。信號1通過配體活化TLR，通過激活NF-κB 等方式介導胞內NLRP3 和 IL-1β 前體表達上調；信號2 通過病原相關分子模式或損傷相關分子模式刺激經信號1 刺激過的細胞，活化NLRP3。而活化的NLRP3炎性小體在各種病原體感染、腫瘤等多種疾病的發生、發展過程中起重要作用［19］。本研究結果顯示，B 組小鼠體內 NF - κB 和NLRP-3 蛋白水平均較 A 組顯著升高，C2組、C3組小鼠體內的 NF- κB 和 NLRP- 3 蛋白水平均較 B 組顯著降低（P< 0.05）。此外，為全面考察小兒柴桂退熱口服液對LPS誘導肺損傷模型小鼠肺組織損傷的干預作用，考察了各組小鼠的血液生化指標，發現C2組、C3組小鼠的WBC，PLT，LYMPH，HCT，NEUT%水平均較B 組顯著改善（P< 0.05），且呈量效正相關。提示應關注上述指標在肺損傷患者臨床治療過程中的變化。

綜上所述，小兒柴桂退熱口服液可改善LPS誘導的肺損傷模型小鼠的肺組織損傷，其作用機制可能與調控NF-κB介導的NLRP3通路有關。