四季茶花夏詠國色葉片愈傷誘導與植株再生研究

王江英， 湯雪燕， 葛金濤， 邵小斌， 孫明偉， 趙統利， 朱朋波*， 李先民

(1.連云港市農業科學院 休閑農業研究室, 江蘇 連云港 222000； 2.廣西農業科學院 花卉研究所, 廣西 南寧 530007)

夏詠國色(CamelliaXiayong Guose)為山茶科山茶屬植物，是以杜鵑紅山茶(C.azalea)為母本和花牡丹(C.Daikagura)為父本雜交選育的四季茶花新品種，是四季茶花系列品種之一，常綠灌木，植株緊湊，枝繁葉茂，葉片濃綠，開花稠密，紅色，是牡丹型中到大型花，花期6月中旬至12月底。四季茶花葉片翠綠，生長旺盛，夏季始花，秋冬盛花，春季亦可持續開花，克服了傳統茶花花期短、夏季無花等缺點[1]。利用組織培養技術建立再生體系為四季茶花大規模無性繁殖和外源功能基因的遺傳轉化提供有效的技術支持，國內外已見以山茶屬植物葉片、莖段和子葉等外植體進行愈傷組織誘導分化成再生植株的相關報道。早在1985年，Kato[2]將茶樹莖段的表皮細胞誘導出愈傷組織，再將愈傷組織轉接至添加0.5 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)和10 mg·L-16-芐氨基嘌呤(6-BA)的基本培養基(MS)中誘導出不定芽；吳斌等[3-4]以耐冬子葉誘導愈傷組織，成功分化出不定芽，并且生根獲得再生植株。

目前杜鵑紅山茶是四季茶花中研究較多品種之一，對其研究較多的是離體快速繁殖，以及利用嫩莖、葉柄、葉片和子葉為外植體進行愈傷誘導[5-10]，直到2013年吳斌等[3]利用莖段培養杜鵑紅山茶的無菌苗，再以其葉片進行了愈傷誘導，成功分化不定芽并獲得再生植株。然而，四季茶花育性差，結實率低，子葉材料少，限制外植體的來源。本研究以四季茶花夏詠國色為材料，利用其葉片為外植體，探索一種通過愈傷組織分化不定芽獲得再生植株的方法，為大規模無性繁殖和遺傳轉化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年11月從山東青島引進夏詠國色1年生嫁接苗，2020年春季抽出新芽，于5月11日采集當年生新葉進行試驗。

1.2 材料處理

選擇生長健壯且無病斑的新葉，洗滌劑輕輕搓洗表面灰塵，自來水反復搓洗至無泡沫，流水沖洗30 min，置于干凈的培養瓶中，蓋上瓶蓋后置于無菌超凈臺備用。

1.3 外植體消毒

在超凈工作臺中，利用75%乙醇(C2H5OH)不同處理(振蕩消毒20、30、45 s)、0.1%升汞(HgCl2)不同處理(3、5、8 min)、2%次氯酸鈉(NaClO)不同處理(3、5、8 min)對外植體進行組合消毒，結束后以無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干水分。小葉片用干凈手術刀橫向劃動，每片劃3～4下，避免葉緣兩端斷裂；大葉片用干凈剪刀剪成約1 cm×1 cm葉盤(圖1)。所有外植體接種于MS空白培養基。每個組合接種9瓶，每瓶接種5塊材料，生物學重復3次，培養溫度25 ℃，光照強度2 500～3 000 lx，光照時間12 h·d-1。15 d后統計污染率、死亡率和成活率。

A—盛花；B—葉片處理，其中，L1～L5為嫩葉，以干凈手術刀片橫切葉片，L6～L7為稍大葉片剪成約1 cm×1 cm葉盤；C—葉片愈傷組織誘導；D—葉片愈傷組織誘導7 d；E—葉片愈傷組織誘導14 d；F—葉片愈傷組織誘導31 d；G—葉片愈傷組織誘導45 d。

1.4 外植體防褐化

外植體消毒后，將其接種至MS培養基，其中MS培養基分2種，分別為空白無添加和添加0.02%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。每種外植體接種9瓶，每瓶接種5塊材料，生物學重復3次，培養條件同上，15 d后統計褐化率。

1.5 初代愈傷組織誘導及繼代增殖

分別將無菌的葉片外植體接種到添加不同濃度2,4-D(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)和不同濃度6-BA(1.0、2.0、4.0 mg·L-1)的MS培養基上，其中MS培養基中添加0.02% PVP、50 mL·L-1椰汁(CW)、蔗糖30 g·L-1、瓊脂7.5 g·L-1，滅菌前調pH至5.8，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。接種后觀察愈傷組織出現和生長情況，培養條件同上，30 d后統計愈傷誘導率。

初代愈傷組織培養60 d后，葉片外植體轉接至添加不同濃度2,4-D(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)和不同濃度6-BA(1.0、2.0、4.0 mg·L-1)的MS培養基上，其中MS培養基中添加50 mL·L-1CW、30 g·L-1蔗糖、7.5 g·L-1瓊脂，滅菌前調pH至5.8，121 ℃高溫高壓滅菌20 min，每30 d轉接1次，共轉接3次，培養條件同上，統計增殖系數。

1.6 不定芽分化

待培養一段時間后，將葉片愈傷再分別轉至添加不同濃度NAA(0.2、0.5、1.0 mg·L-1)和不同濃度6-BA(5.0、8.0、10.0 mg·L-1)的MS培養基上。其中MS培養基還添加100 mL·L-1CW、100 mg·L-1谷氨酰胺(Gln)、100 mg·L-1脯氨酸(Pro)、蔗糖30 g·L-1、瓊脂7.5 g·L-1。培養基滅菌前調pH至5.8，121 ℃高溫高壓滅菌20 min，培養條件同上，60 d后統計不定芽分化率。

1.7 不定芽生根誘導

待成型的不定芽長至1.5～3.0 cm的粗壯芽后，切取單芽，基部分別用200、500 mg·L-1IBA濃度浸泡處理30、70、100 min，然后轉至1/2MS固體培養基上誘導生根[4]。每瓶接種3個單芽，共接種10瓶，重復3次，45 d后統計不定芽的生根率。

1.8 數據統計

運用Excel 2007軟件和SPSS 21.0軟件對數據進行處理分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒體系的建立

不同消毒處理下，污染率、死亡率和成活率均呈顯著性差異。消毒時間太短污染率會增加，消毒時間過長，污染率雖然下降，但容易導致外植體損傷死亡，不易成活。從表1可以看出，夏詠國色葉片適宜的消毒處理有2種，分別為處理5和處理15。

表1 不同處理方法對外植體的影響

2.2 外植體防褐化處理

從表2可以看出，小葉片橫切的褐化率低于大葉片剪葉盤(處理1和2)，而MS培養基中添加0.02% PVP顯著降低褐化率，其中小葉片橫切褐化率由55.56%降至22.96%(處理1和3)，大葉片剪葉盤褐化率也由70.37%降至29.63%(處理2和4)。由此可以推測，葉片表面傷口處有酚類物質溢出，面積越大，褐化率越高。

表2 不同處理方法對外植體褐化的影響

2.3 愈傷組織誘導

由表3可見，當2, 4-D濃度為2.0 mg·L-1、6-BA濃度為4.0 mg·L-1時(處理9)，葉片愈傷誘導率最高，達90.37%。葉片愈傷組織誘導過程如圖1中C，培養7 d后，葉片切口有點發紅，少許葉片切口褐化(圖1中D)；培養14 d后，邊緣開始出現凹凸，說明愈傷組織誘導已經開始啟動(圖1中E)；經過31 d后，淡黃色至淺綠色的白色顆粒狀愈傷組織生長在葉片切口處(圖1中F)；接種45 d后，愈傷組織基本覆蓋葉片切口表層，淡黃色或淺黃綠色，少量材料愈傷組織表面會稍微泛紅(圖1中G)。

表3 不同培養基對初代愈傷組織誘導的影響

2.4 愈傷組織繼代培養

將葉片愈傷組織分別轉接至繼代培養基中繼續培養。由表4可見，當2, 4-D濃度為0.5 mg·L-1、6-BA濃度為2.0 mg·L-1時(處理2)，葉片愈傷增殖速度最快，增殖系數高達5.30。其中葉片愈傷組織繼代培養30 d后觀察發現，愈傷組織質地蓬松，淺綠至淡黃色，顆粒大小不一(圖2中A)，繼代培養60 d的愈傷淺綠色，疏松的細顆粒狀，少數呈紅色(圖2中B)。

表4 不同培養基對愈傷組織繼代培養的影響

2.5 不定芽分化

葉片繼代培養的部分愈傷組織經3次轉接之后，分別轉移至不定芽分化培養基中(表5)。葉片愈傷組織接種至培養基中添加0.5 mg·L-1NAA和10.0 mg·L-16-BA時(處理6)，不定芽分化率較高。經觀察發現，轉接約45 d后，部分葉片愈傷組織表面發白，質地緊密，大部分較為疏松，從淺黃色透亮的愈傷組織中出現小芽，小芽不斷發育成型，其基部會有更多小芽分化出來，之后發育成大小不等的叢生芽(圖2中C)，60 d后統計不定芽，其分化率約為37.78%。

表5 不同培養基對不定芽分化的影響

A—繼代培養30 d的葉片愈傷組織；B—繼代培養60 d的葉片愈傷組織；C—葉片愈傷組織分化出不定芽。

2.6 不定芽生根誘導

待不定芽長至1.5～3.0 cm成型的芽條時，可切下進行生根誘導(圖3中A)。

從表6可以看出，芽條經500 mg·L-1IBA浸泡70 min(處理5)，約34.44%的芽條長出較健壯的幼根。經觀察發現，芽條弱光培養20 d后，基部或莖段底部稍微膨大，并伴隨小顆粒的愈傷長出(圖3中B)；隨著培養時間推移，愈傷組織逐漸增多，少許芽條有淺綠色至白色根尖從膨大部位長出，30 d后幼根長約3～4 cm，根表面有少許透明狀軟絨毛附著(圖3中C)；一旦幼根出現，在培養瓶中便生長迅速(圖3中D)，再培養15～20 d后，有少許側根長出，圖3中E顯示生根培養90 d的狀態。

A—叢生芽；B—不定芽生根培養；C—主根形成；D—主根生長；E—側根形成。

表6 不同處理對不定芽生根的影響

3 小結與討論

外植體選擇是愈傷組織誘導的前提，減少污染和降低褐化率是外植體成功接種的2個關鍵因素。山茶屬植物多酚類物質含量較高，在組織培養過程中外植體切口會分泌出一些酚類物質，產生褐化現象[11]。有研究發現，褐變會隨著茶樹培養材料年齡的增長和組織木質化程度的提高而加劇[12]。核桃中的酚類物質含量也較高，組織培養過程中發現木質化程度高的外植體會促進褐化的發生，通常幼齡外植體比老齡外植體褐化輕，褐化率低[13-14]。鑒于此，本研究選取當年生嫩葉為外植體，減少酚類物質從切口的溢出，從而降低褐化率。另外，本研究愈傷誘導培養基中添加0.02% PVP也進一步降低褐化發生。

幼嫩葉片在消毒時容易受到損傷，吳斌等[3]對山茶葉片表面用75%的乙醇消毒30 s，接著0.1%HgCl2浸泡8 min，而田紅梅等[4]用2% NaClO滅菌8 min均可達到較好的消毒效果。本試驗前期研究發現，0.1% HgCl2浸泡8 min或2%NaClO浸泡10 min外植體表面消毒效果較好，由于本研究所采集的外植體均比較幼嫩，易發生灼燒，顏色由綠色變成褐黃色。因此，外植體消毒前用洗滌劑反復沖洗后，選擇0.1% HgCl2浸泡5 min或2% NaClO浸泡8 min，可有效降低污染率。

本研究前期研究發現，使用低濃度2,4-D(0.05 mg·L-1)和6-BA(2.0 mg·L-1)，夏詠國色葉片愈傷誘導緩慢，一段時間后，愈傷表面有糖霜感，顏色由淺綠變為深綠，質地緊密；而將2,4-D和6-BA的濃度升至2.0和4.0 mg·L-1時，約接種后14 d已見愈傷組織出現，質地蓬松，顏色淺綠。約15 d后，轉接至繼代培養基時必須將2,4-D和6-BA降至0.5和2.0 mg·L-1，另外可選擇性添加2 g·L-1活性炭吸附愈傷組織中多余的激素，避免愈傷組織增殖過快易老化，后期影響不定芽的分化。

此次不定芽誘導生根只在1/2 MS固體培養基中進行，“濾紙橋生根法”試驗后續還在進行中。在后期的試驗中，可將影響因素進一步細化研究，從而建立更為有效的再生體系。