蟬花菌質在飼料中應用安全性初探

紀偉， 劉曉梅， 蘇文英， 孫長勝， 閆文娟， 柴文波， 任立凱*

(1.連云港市農業科學院，江蘇 連云港 22200； 2.浙江泛亞生物醫藥股份有限公司，浙江 嘉興 314200)

蟬花(IsariacicadaeMiquel)在《本草綱目》《圖經本草》和《經史證類備急本草》等古代經典醫學論著均有記載，具有豐富的營養價值[1-5]。別稱金蟬花、胡蟬、蟬蛹草等，是麥角菌科真菌蟬棒束孢寄生在蟬科竹蟬、螻蛄、山蟬及黑蚱等的若蟲[6-7]，氣候環境適宜時，吸收蟲體的營養轉化成菌絲體，頂端分枝“發芽”，形似花冠，故而稱為蟬花[4,8-9]。蟬花菌質是將蟬花子實體采收后剩余的培養基，在發酵過程中，培養基大部被分解轉化，里面含有部分蟬花蟲草菌絲體，故命名為蟬花菌質[5]。根據文獻記載，蟬花經人工培育，其菌絲體不僅含有腺苷、多糖等活性成分，還含有豐富的氨基酸、微量元素、D-甘露醇和核苷類、維生素類、蕈糖和硬脂酸等物質[3,10]。開發應用這部分資源，不僅為蟬花子實體收獲后的培養基解決了出路問題，而且變廢為寶，大大提高了蟬花培養物的附加值[11]。依據《新食品原料安全性審查管理辦法》和《食品安全法》的規定，蟬花子實體(人工培植)已通過國家食品安全風險評估中心專家評審委員會技術審查，并于2021年1月7日被國家衛生健康委員會批準為“新食品原料”，成為我國100余種新食品原料的新晉成員[12-13]。所使用的蟬花菌株和蟬花子實體(人工培植)的安全性已得到認可，關于蟬花菌質的安全性研究還未有公開報道。本研究通過蟬花菌質小鼠經口急性毒性試驗、雌性小鼠和雄性小鼠的小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠的精子畸形試驗開展蟬花菌質的安全性評價工作，為蟬花菌質納入飼料原料目錄和應用于飼料行業提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 蟬花菌質

蟬花菌質為蟬花人工培育完成后，采收完蟬花子實體的小麥培養基。在發酵過程中，小麥培養基大部分被分解轉化，里面含有部分蟬花蟲草菌絲體，該樣品為浙江泛亞生物醫藥股份有限公司制備提供。

1.2 供試材料

小鼠經口急性毒性試驗：SPF級ICR小鼠購買50只，雌雄各半，分2次購入，試驗動物為5～6周齡，體重18～22 g；小鼠骨髓細胞微核試驗：SPF級ICR小鼠100只，雌雄各半，試驗動物為7～12周齡，體重25～30 g；小鼠精子畸形試驗：SPF級雄性ICR小鼠50只，試驗動物為6～8周齡，體重25～35 g。以上試驗動物均購自北京為通利華動物科技有限公司，試驗動物合格證號為SCXK(京)2016-0011。

1.3 主要試劑和儀器

環磷酰胺(Beijing Giant-Carrier Co.Ltd)；吐溫-80(國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸二氫鉀(國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸氫二鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；小牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；甲醇(國藥集團化學試劑有限公司)；羧甲基纖維素鈉(北京化學試劑公司)；丙三醇(國藥集團化學試劑有限公司)；吉姆薩染料(北京華博源科技開發中心)；伊紅(曙Y，北京化學試劑公司)；香柏油(國藥集團化學試劑有限公司)；中性樹脂膠(國藥集團化學試劑有限公司)。隔水式恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)；數顯恒溫水浴鍋(金壇醫療儀器廠)；生物顯微鏡(日本Olympus公司)；酸度計(意大利HANN公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 小鼠經口急性毒性試驗

預試驗：設置高劑量組為5 000 mg·kg-1體重，以3.125倍遞減設置高、中、低3個劑量組，即分別以5 000、1 600、512 mg·kg-1為高、中、低劑量組開展預試驗，以期找到0/4致死劑量和4/4致死劑量。預試驗各劑量組的小鼠數量均為4只(雌雄各半)，按灌胃體積為0.02 mL·g-1體重，將受試物用1%的羧甲基纖維素鈉配置成混懸液，依次將高、中、低劑量組經口灌胃染毒。染毒后觀察小鼠的情況，包括一般表現、中毒癥狀和死亡情況，觀察周期為1～2周，并對死亡小鼠剖檢處理，做好試驗記錄。根據預試驗的結果發現，預試驗各劑量組小鼠(雌雄各半)均未出現死亡情況。

正式試驗：依據預試驗的結果，將染毒劑量確定為5 000 mg·kg-1體重作為正式試驗的染毒劑量。將30只試驗用小鼠隨機分成3組，每組10只(雌雄各半)，將受試物用1%的羧甲基纖維素鈉配置成混懸液，經口灌胃染毒。染毒后觀察小鼠的情況，包括小鼠的一般表現中毒癥狀和死亡情況，連續觀察7 d，若4 d后繼續有死亡的情況，觀察時間需要14 d，必要時可以延長至28 d，并對死亡的小鼠剖檢處理，做好詳細記錄。如果所有試驗小鼠均未出現死亡情況，則需要在試驗結束時每組隨機挑選2只小鼠進行大體剖檢并做好詳細記錄[14]。

1.4.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

染毒劑量與分組。依據農業部公告第1247號-12獸藥小鼠精子畸形試驗指導原則，在受試物LD50大于5 000 mg·kg-1體重時，試驗組高劑量設為5 000 mg·kg-1體重，將2 500和1 250 mg·kg-1體重設為中劑量組和低劑量組，另設1個陰性(溶劑)對照組和1個陽性對照組。陽性對照物選用環磷酰胺，按40 mg·kg-1體重劑量給予。分別將小鼠按每組20只(雌雄各半)，分為5組進行試驗[15]。

受試物的配制與染毒。將受試物按各測試濃度用1%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，染毒方式采用經口灌胃法，用1%羧甲基纖維素鈉對陰性對照組進行灌胃；按2 mg·mL-1濃度配制對陽性對照組小鼠進行經口灌胃染毒，小鼠灌胃體積為每克體重0.02 mL。每日1次，連續2 d給藥。

標本制備。選取在第二次給予受試物6小時后的小鼠，隨機選取雌性和雄性小鼠各5只，使用頸椎脫臼法隨機處死，將每只小鼠的兩側股骨取下，剔除肌肉，去除表面血污，將股骨兩端剪去。用移液槍吸取小牛血清0.2 mL沖洗骨髓腔數次，在相應編號的載玻片上滴上沖洗物；將骨髓腔沖洗物在玻片上涂勻后，推片，每只小鼠2張，快速干燥；將干燥的涂片固定于甲醇中，10 min后取出晾干；吉姆薩應用液20 min染色后，使用蒸餾水沖洗，晾干，待查；閱片。用雙盲法鏡閱片，選擇著色濃淡適中區域分散均勻、完整的細胞，用油鏡觀察。每只小鼠涂片計數1 000個以上嗜多染紅細胞(PCE)數，觀察并計數其中有核的PCE數。同時在同一視野下觀察計數成熟紅細胞(RBC)數，并記錄每只小鼠RBC數、含微核PCE細胞數、PCE檢查數[16]。

1.4.3 小鼠精子畸形試驗

染毒劑量與分組。依據農業部公告第1247號-11獸藥小鼠精子畸形試驗指導原則，當受試物半數致死量(LD50)>5 000 mg·kg-1時，試驗組高劑量設為5 000 mg·kg-1，將2 500和1 250 mg·kg-1體重設為中和低劑量組，另設1個陰性(溶劑)對照組和1個陽性對照組。選用環磷酰胺作為陽性對照組，按40 mg·kg-1體重劑量給予。將雄性ICR小鼠隨機分組，每組10只，分為5組進行試驗。

受試物的配制與染毒方法。將受試物按各測試濃度用1%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，染毒方式采用經口灌胃法，用1%羧甲基纖維素鈉對陰性對照組進行灌胃；按2 mg·mL-1濃度配制對陽性對照組小鼠進行經口灌胃染毒，小鼠灌胃體積為每克體重0.02 mL。每日1次，連續5 d給藥。

采樣和制片。每個劑量組選取5只小鼠采樣、制片，一般選擇在第一次染毒后35 d后的小鼠。處死小鼠的方法采用頸椎脫臼法，剪開腹腔，將摘取的兩側附睪放入盛有2 mL生理鹽水的平皿中；將附睪縱向剪1刀，用吸管吸取其中的生理鹽水吹打數次，凈置5 min；使用4層擦鏡紙過濾，除去組織碎片，在載玻片上滴濾液2滴，推片，樣片制片4張/只小鼠；采用自然干燥后，用甲醇固定10 min，干燥；使用2%的伊紅染色50 min，用水沖洗染液，自然晾干。

閱片。先在低倍鏡下找到精子重疊較少、背景清晰的區域，再在高倍鏡下觀察精子形態。精子明顯是人為剪碎、頭部與其他精子及碎片重疊或有頭無尾(輪廓不清)者均不計數。每個劑量組分別檢查精子1 000條，對在同一視野中的畸形精子進行分類計數，包括雙尾、尾折疊、分無鉤、胖頭、香蕉形、雙頭、無定形，做好詳細記錄。

2 結果與分析

2.1 小鼠經口急性毒性試驗結果

正式試驗中所有受試ICR小鼠在試驗觀察期內均未出現中毒癥狀，亦未見死亡，且試驗結束后大體剖檢小鼠的腎臟、肺臟、脾臟、肝臟、胃腸道、心臟等組織器官，均未發現異常變化。

經口染毒劑量按5 000 mg·kg-1體重，經重復試驗3次，在試驗觀察期內ICR小鼠死亡率詳見表1，結果均為0，可判定蟬花菌質對ICR小鼠經口急性毒性試驗的LD50大于每公斤體重5 000 mg。

表1 動物死亡結果

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗結果

根據表2、3可知，陽性對照組2種性別小鼠骨髓細胞中含微核嗜多染紅細胞率顯著高于陰性對照組相應性別，而蟬花菌質各劑量組雌、雄小鼠骨髓含微核嗜多染紅細胞率與陰性對照組之間比較無顯著性差異，且各試驗組嗜多染紅細胞(PCE)與成熟紅細胞(RBC)比值(PCE/RBC)在正常范圍內，表明蟬花菌質在1 250～5 000 mg·kg-1體重劑量對雌、雄小鼠骨髓中嗜多染紅細胞(PCE)的微核率無顯著影響，可判定蟬花菌質的小鼠骨髓細胞微核試驗結果為陰性。

表2 蟬花菌質小鼠骨髓細胞微核試驗結果(雌性小鼠)

表3 蟬花菌質小鼠骨髓細胞微核試驗結果(雄性小鼠)

2.3 小鼠精子畸形試驗結果

從表4可以看出，陽性對照組精子畸形率極顯著高于陰性對照組，蟬花菌質在1 250～5 000 mg·kg-1體重劑量范圍內小鼠精子畸形率與陰性對照組比較無顯著性差異，可判定蟬花菌質小鼠精子畸形

表4 蟬花菌質小鼠精子畸形情況

試驗結果為陰性。從表5可以看出，蟬花菌質在1 250～5 000 mg·kg-1體重劑量小鼠各類精子畸形百分率中“無鉤”占百分比最高，其次是“無定形”，各類畸形精子百分率中“雙尾”占百分比最低。

表5 蟬花菌質小鼠精子畸形比例

3 討論

本研究包括蟬花菌質小鼠經口急性毒性試驗(LD50測定)、雌性小鼠和雄性小鼠的小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠的精子畸形試驗，以期通過以上試驗開展蟬花菌質在飼料中應用的安全性評價工作。研究結果表明，受試的所有ICR小鼠在試驗觀察期內均未見中毒癥狀和死亡情況，在試驗結束后大體剖檢小鼠的腎臟、肺臟、脾臟、肝臟、胃腸道、心臟等組織器官，均未發現異常變化。根據本試驗判定，蟬花菌質對ICR小鼠經口急性毒性試驗的LD50大于5 000 mg·kg-1體重。蟬花菌質在1 250～5 000 mg·kg-1體重劑量經口染毒后，各小鼠骨髓細胞中含微核嗜多染紅細胞(PCE)率和小鼠精子畸形率與陰性對照組比較均無顯著性差異，說明小鼠骨髓細胞微核試驗結果和小鼠精畸形試驗結果均為陰性。以上試驗表明，蟬花菌質具有很好的安全性，為蟬花菌質應用于飼料工業等領域提供科學理論依據。